DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Einzelne Muskelfasern sind groß, hoch organisierte Syncytial-Zellen. Es gibt einige Zellkulturmodelle für Muskel; jedoch haben diese Modelle als ihre wichtigste Einschränkung, dass sie nicht vollständig zu reifen Muskelfasern unterscheiden. Beispielsweise werden die C2C12 und L6-Zelllinien von Mäusen und Ratten, jeweils 1-4 abgeleitet sind. Unter den Bedingungen der Serumentzug, die einkernigen "Myoblasten-like" Zellen aufhören Proliferation, Zellzyklus Entzug zu unterziehen, und geben Sie in die myogenen Programm bildet kernige Zellen mit Sarkomere, die so genannte Myotuben. Bei längerer Kulturbedingungen kann Myotuben Kontraktionseigenschaften aufweisen und "zucken" in der Kultur. Menschlichen Zelllinien wurden auch jetzt 5 etabliert. Neben diesen immortalisierten Zellinien können einkernige Myoblasten aus Muskel- und unter den gleichen Bedingungen von Serumentzug wird Myotuben Form isoliert werden. Diese Zelllinien und Primär Myoblastenkulturen sind hoch verwendenvoll, da sie die mit Plasmiden transfiziert oder transduziert mit Viren und zur Basiszelle biologische Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind diese Zellen, selbst wenn veranlasst, Myotuben zu bilden, fehlt vielen der wichtigsten Merkmale von reifen Muskel Organisation. Insbesondere sind Myotuben viel kleiner als einzelnen reifen Muskelfasern und nicht über die normale Form der Muskelfasern. Kritisch Myotuben fehlt Quer (T-) Tubuli, die membranartige Netzwerk für effiziente Ca 2+ Freisetzung der gesamten myoplasm erforderlich.
Eine alternative Methode zur primären Myoblasten oder myogenen Zelllinien bringt mit reifen Muskelfasern. Transgenese verwendet werden, um die Expression von markierten Proteinen herzustellen, jedoch ist dieses Verfahren kostenintensiv und zeitraubend ist. In vivo Elektroporation von Maus-Muskel wurde als ein bevorzugtes Verfahren zu seiner Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit 6-10 entstanden.
Verfahren zur in vivo Elektroporation und effiziente Isolierung von Muskelfasern have für die Maus flexor digitorum brevis (FDB) Muskel 6 optimiert. Die Verfahren können leicht durchgeführt werden und sind minimal-invasive in vivo-Expression von Plasmiden zu induzieren. Dieser Ansatz wird jetzt mit hochauflösenden bildgebenden Verfahren einschließlich Bildgebung nach der Laser Störung des Sarkolemma 6,7 kombiniert. Die Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen und die Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine können verwendet werden, um zellbiologische Prozesse in reifen Muskelfasern zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung der Elektroporation zur fluoreszenzmarkierten Proteine in vivo zu untersuchen ist besonders für die Untersuchung von Muskeln aufgrund der Abwesenheit von geeigneten Zellinie Modelle, die die gesamte Zellstruktur des Muskels originalgetreu geeignet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Elektroporation und hochauflösende konfokale Mikroskopie, detaillierte Darstellung von Protein-Lokalisierung und Translokation nach der Laser Verwundung bereitzustellen. Diese Methode läs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health NS047726, NS072027 und AR052646 unterstützt gewährt.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
Referências
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