Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto
Summary
Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
A cóclea em forma de espiral do ouvido interno, contida dentro do osso temporal, abriga o órgão de Corti, o órgão auditivo final sensorial em mamíferos. A cóclea é tonotopically organizado e comumente dividido em apical, médio e basal voltas correspondente a regiões de frequência diferentes, com a detecção de som de alta freqüência na base e detecção de baixa frequência no ápice 1. As células ciliadas, as células mecanosensorial do órgão de Corti, executar o comprimento da cóclea, que é de aproximadamente 6 mm de comprimento de ratos 2,3. Estas células converter a energia mecânica de ondas sonoras, que são transmitidas através do labirinto membranoso cheio de fluido, em sinais neurais que são processadas pelas estruturas auditivas centrais. A técnica aqui descrita fornece um método para a preparação de peças inteiras de o órgão de Corti, após a calcificação da cóclea está completa (para as amostras que vão desde uma semana de idade até à idade adulta). Nós também apresentamos um método para immunostaining tudo montado tecido coclear. Cocleares peças inteiras são cruciais para a visualização de todas as células do cabelo e que envolve as células de suporte nos seus arranjos espaciais naturais e permitir a análise em três dimensões, com a utilização de microscopia confocal.
Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originalmente descrito um método de montar todo dissecção coclear em 1966. Eles detalhado uma técnica para corrigir rapidamente e dissecar cócleas calcificada submersa no líquido a partir de uma variedade de mamíferos, preservando curtos segmentos intactos do órgão de Corti para análise microscópica 4. A dissecção de um unfixed, calcificada cóclea de rato também foi ilustrado em um vídeo instrutivo 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding na Universidade de Washington fez várias modificações importantes a este método. Em sua versão da coclear método montar todo, o osso temporal foi descalcificado, embutido no plástico, e cinco meias-voltas ou dez quartos-de-voltas foram dissecçãoted 6,7. Dr. Charles Liberman e colegas Eaton Peabody, Massachusetts Eye Laboratories e Ear Infirmary, modificou esta técnica para que a incorporação de plástico não foi necessário 8. Além disso modificação da técnica ocorreu no laboratório do Dr. Jian Zuo no Hospital de Pesquisa St. Jude Children 9-12 que informou o método de dissecação aqui apresentada. Nós usamos uma estratégia diferente para obter acesso ao órgão de Corti que Bohne e Liberman, que permite o isolamento completo da apical, média e basal voltas. Assim, o tecido dissecado é maior e menos susceptível de ser danificado ou perdido durante os processos de dissecção ou imunocoloração. Além disso, o método actual de facilitar a medição da distância a partir da extremidade apical ou gancho basal para identificar uma região de frequência.
Embora muitos laboratórios realizar immunostaining de tecido coclear, não está claro onde este método foi originada. Como resultado, há várias receitas para o bloqueio da-manhãrs e tampões de incubação de anticorpos que podem afetar o desempenho de anticorpos primários individuais. Aqui, nós apresentamos um método para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência que é aplicável aos anticorpos mais comumente utilizados no campo auditivo.
A forma complexa da cóclea, delicada estrutura do órgão de Corti, e encaixe ósseo proporcionar um desafio para análise histológica e bioquímica. Uma variedade de técnicas são actualmente usados no campo de audiência para superar estas características difíceis e visualizar as células dentro do órgão de Corti, cada técnica com as suas próprias vantagens e desvantagens. O protocolo aqui apresentado permite a montagem de dissecção toda a cóclea de rato adulto e, com ligeira modificação, pode potencialmente ser usado para examinar as estruturas críticos dentro do cócleas a partir de uma variedade de outros organismos modelo utilizados no campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há vários passos críticos para toda bem sucedido dissecção montagem e immunostaining. Contudo, antes de qualquer um destes métodos são realizados, é necessária a fixação adequada do tecido coclear. Recomendamos a utilização de metanol livre, ultra-pura, EM grau PFA. PFA feita a partir de pó pode ter vestígios de metanol e um pH instável o que diminui a qualidade de imunofluorescência. Outros grupos também mostraram que dissecções semelhantes são possíveis usando fixadores que não contêm for…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
Referências
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. . Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters’ cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
