Hurtig Enzymatisk behandling af proteiner til MS Detection med en Flow-through Mikroreaktor
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
Langt størstedelen af massespektrometri (MS) -baseret protein analysemetoder involverer en enzymatisk spaltning trin før detektion, typisk med trypsin. Dette trin er nødvendigt for dannelsen af små molekylvægt peptider, generelt med MW <3.000-4.000 Da, der falder inden for det effektive scanning række massespektrometri instrumentering. Konventionelle protokollerne omfatter O / N enzymatisk nedbrydning ved 37 ºC. Nylige fremskridt har ført til udviklingen af en række forskellige strategier, der typisk involverer anvendelsen af en mikroreaktor med immobiliserede enzymer eller af en række supplerende fysiske processer, der reducerer den nødvendige tid til proteolytisk spaltning til et par minutter (f.eks mikrobølge eller høj- tryk). I dette arbejde, beskriver vi en enkel og omkostningseffektiv tilgang, der kan implementeres i alle laboratorier for at opnå hurtig enzymatisk fordøjelse af et protein. Proteinet (eller proteinblanding) adsorberes på C18-bundet omvendt fase performance væskekromatografi (HPLC) silicapartikler indlæst i en kapillarkolonne, og trypsin i vandig puffer infunderes over partiklerne for en kort periode. At muliggøre online MS detektion er de tryptiske peptider elueret med et opløsningsmiddelsystem med øget organisk indhold direkte i MS ionkilde. Denne fremgangsmåde undgår brugen af dyre immobiliserede enzym partikler og ikke nødvendiggør nogen støtte til at fuldføre processen. Protein fordøjelse og fuldstændig prøveanalyse kan gennemføres på mindre end ~ 3 min og ~ 30 min.
Introduction
Identifikationen og karakteriseringen af oprensede proteiner er ofte opnået ved hjælp af MS-metoder. Proteinet spaltes med et enzym og dets peptider yderligere analyseret ved MS ved hjælp af en simpel infusion forsøgsopstillingen. Proteolytisk fordøjelse er nødvendig til generering af små peptidfragmenter, der falder i den nyttige masseinterval fleste MS analysatorer, og som let kan fragmenteres ved lav energi kollision induceret dissociation at generere aminosyresekvens information. For isolerede proteiner eller simple proteinblandinger, der ikke længere behov for kromatografisk separation af peptider forud for MS-detektion. En blanding af 25-50 peptider kan let analyseres ved infusion prøven med en sprøjtepumpe direkte i MS ionkilde.
Massespektrometret kan udføre analysen og bekræfte sekvensen af et protein inden for en kort tidsramme. Med moderne datafangst metoder, kan denne proces ske wnden et par minutter eller endda sekunder. Den begrænsende faktor i at fuldføre hele processen på en kort tidshorisont er den proteolytiske fordøjelse trin. Typisk udføres dette over nogle få timer (eller O / N), i opløsning, ved 37 ºC, ved hjælp substrat: enzym-forhold på (50-100): 1. For at reducere den enzymatiske fordøjelse tid til minutter eller sekunder, immobiliserede enzym mikroreaktorer, i form af mikrofluide reaktorer eller kommercielt tilgængelige patroner, er beskrevet. 1-6 Typisk enzymet immobiliseret ved kovalent, ikke-kovalent / fysisk adsorption, kompleks dannelse eller indkapsling, idet 3,6 den forbedrede effektivitet af den enzymatiske proces aktiveret af den store overflade-til-volumen og enzym-til-substrat-forhold. Yderligere fordele ved immobiliserede reaktorer omfatter reduceret autolyse og interferens fra enzymet i MS-analyse, forbedret enzymstabilitet og genanvendelighed. En række metoder, ved hjælp af glas eller polymere microfabrikerede enheder er blevet beskrevet,anvendelse af enzymer immobiliseret på magnetiske perler af antistof-antigen interaktioner, 7,8 indfanget i guld nanopartikler netværk, 9 indkapslet i titaniumdioxid-aluminiumoxid sol-geler 10 og nanozeolites, 11 eller fanget gennem Ni-NTA eller His-Tag kompleksdannelse. 6 Alternativt , open-rørformede kapillærer med immobiliserede enzymer er blevet udviklet, så godt. 12. Desuden forbedret proteolytisk spaltning er blevet påvist ved hjælp af kontrolleret mikrobølge bestråling 13 eller tryk-assisteret eller tryk cykling teknologi (PCT) til at reducere reaktionstider til 30-120 min. 14
Trods de mange fordele ved immobiliseret enzym reaktorer, omkostningerne ved kommercielle patroner er høj, tilgængeligheden af mikrofluide anordninger til rutinemæssig anvendelse er begrænset og anvendelse af mikrobølgeovne eller PCT teknologier resulterer i behovet for yderligere instrumentering. Målet med dette arbejde var at udvikle en metode, circumvents disse ulemper, og som let kan implementeres i alle laboratorier at give forskere med en enkel og effektiv metode til udførelse af enzymatisk spaltning af proteiner som forberedelse til MS-analyse inden for få minutter. Tilgangen bygger på anvendelsen af hydrofobe, C18-partikler, som er forbelastet i en kapillær eller mikrovæskeanordning, og adsorptionen af protein (er) af interesse på disse partikler efterfulgt af enzymatisk fordøjelse under infusionen af enzymet over pakket leje og erobrede protein (er). I denne fremgangsmåde er substratet immobiliseres via ikke-kovalente interaktioner, og enzymet er infunderes over det immobiliserede protein. Den proteolytiske fordøjelse effektivitet forøges med de store partikel overfladearealer, som udsætter proteinet for enzymatisk behandling, reducerede afstande og diffusionstider til og fra overfladen af partikler, forbedret masseoverføring, ingen kovalent binding, som kan påvirke aktiviteten af enzymet, evne for hurtigt evaluate kombinationer af forskellige enzymer, disposability og multiplexing hvis processen udføres i en mikrofluid format. Denne fremgangsmåde er demonstreret ved anvendelse af en blanding af standard proteiner og trypsin-den mest almindeligt anvendte enzym til proteolytisk fordøjelse før ESI-MS-detektion. Et massespektrometer til påvisning i denne undersøgelse var en lineær fælde kvadrupol (LTQ) instrument.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den i dette arbejde mikroreaktor indeholder en nem at implementere forsøgsopstilling til udførelse enzymatisk fordøjelse af proteiner for at muliggøre MS-analyse og identifikation i mindre end 30 min. De forskellige fordele ved dette system i sammenligning med konventionelle metoder, indbefatter enkelhed, hastighed, lavt reagensforbrug og lave omkostninger. Især er der ikke behov for dyre immobiliserede trypsin perler og patroner. Forberedelsen af kapillære mikroreaktor er ligetil (figur 1A), og k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Referências
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
