Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
Die überwiegende Mehrheit der Massenspektrometrie (MS) -Basis Proteinanalyseverfahren beinhalten ein enzymatisches Verdauungsschritt der Detektion vor, typischerweise mit Trypsin. Dieser Schritt ist für die Erzeugung von niedermolekularen Peptide erforderlich, in der Regel mit MW <3000-4000 Da, die innerhalb des effektiven Scan-Bereich der Massenspektrometrie Instrumentierung fallen. Herkömmliche Protokolle beinhalten O / N enzymatische Verdauung bei 37 ºC. Jüngste Fortschritte haben zu der Entwicklung einer Vielzahl von Strategien geführt, in der Regel die Verwendung eines Mikroreaktor mit immobilisierten Enzymen oder aus einer Reihe von komplementären physikalischen Prozessen beteiligt, die die Zeit , die für proteolytischen Verdau zu einigen Minuten (beispielsweise Mikrowellen- oder Hoch reduzieren Druck). In dieser Arbeit beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Lösung, die in einem Labor für die Erreichung schnelle enzymatische Verdauung eines Proteins umgesetzt werden können. Das Protein (oder Proteingemisch) adsorbiert an C18-gebundene Umkehrphasen-Hochleistungormance Flüssigchromatographie (HPLC) Siliciumdioxidteilchen in einer Kapillarsäule vorgespannt, und Trypsin in wässrigem Puffer wird für eine kurze Zeit über die Teilchen infundiert. Zu ermöglichen Online-MS-Detektion, die tryptischen Peptide werden mit einem Lösungsmittelsystem mit einem erhöhten Gehalt an organischen Stoffen direkt in der MS-Ionenquelle eluiert. Dieser Ansatz vermeidet die Verwendung von hochpreisigen immobilisiertem Enzympartikel und erforderlich macht keine Hilfe für den Prozess abzuschließen. Protein Verdauung und vollständige Probenanalyse kann in weniger als ~ 3 min und ca. 30 min bzw. erreicht werden.
Introduction
Die Identifizierung und Charakterisierung der gereinigten Proteine wird unter Verwendung von MS-Techniken häufig erreicht. Das Protein wird mit einem Enzym verdaut und die Peptide werden weiter durch MS analysiert, indem eine einfache Infusionsversuchsaufbau verwendet. Proteolytische Verdauung ist zur Erzeugung von kleinen Peptidfragmente notwendig, die in der nützlichen Massenbereich von den meisten MS-Analysatoren fallen, und das kann leicht durch geringe Energiestoßinduzierte Dissoziation fragmentiert werden, um Aminosäuresequenzinformation zu erzeugen. Für isolierte Proteine oder Proteingemische einfache, gibt es keine weitere Notwendigkeit für die chromatographische Trennung von Peptiden vor der MS-Detektion. Eine Mischung aus 25-50 Peptide können leicht durch Infundieren der Probe mit einer Spritzenpumpe in den MS-Ionenquelle direkt analysiert werden.
Das Massenspektrometer kann die Analyse durchzuführen und die Sequenz eines Proteins innerhalb einer kurzen Zeitrahmen zu bestätigen. Bei modernen Datenerfassungsverfahren kann dieses Verfahren durchgeführt werden wnnerhalb ein paar Minuten oder sogar Sekunden. Der begrenzende Faktor des gesamten Prozesses in Vollendung auf einer kurzen Zeitskala ist die proteolytischen Verdauungsschritt. Normalerweise ist dies ein paar Stunden (oder O / N) durchgeführt über, in Lösung, bei 37 ° C, unter Verwendung von Substrat: Enzym-Verhältnisse von (50-100): 1. Um die enzymatische Digestionszeit auf Minuten oder Sekunden, immobilisierte Enzym Mikroreaktoren, in Form von Mikrofluidik – Reaktoren oder handelsüblichen Kartuschen zu verringern, sind beschrieben worden. 1-6 Typischerweise wird das Enzym durch kovalente, nicht-kovalente / physikalische Adsorption, Komplex immobilisiert 3,6 die verbesserte Effizienz des enzymatischen Verfahrens durch die große Oberfläche-zu-Volumen und Enzym-zu-Substrat – Verhältnisse Bildung oder Verkapselung, aktiviert zu werden. Weitere Vorteile von immobilisierten Reaktoren sind ua Autolyse und Störungen durch das Enzym in MS-Analyse reduziert, Enzymstabilität und Wiederverwertbarkeit verbessert. Eine Vielzahl von Ansätzen unter Verwendung von Glas- oder Polymer mikrofabrizierten Vorrichtungen beschrieben worden sind,Enzyme immobilisiert auf magnetischen Kügelchen durch Antikörper-Antigen – Wechselwirkungen unter Verwendung 7,8 in Gold – Nanopartikel Netzwerke eingeschlossen, 9 in Titandioxid-Aluminiumoxid – Sol-Gele 10 und nanozeolites verkapselt, 11 oder gefangen durch Ni-NTA oder His-Tag – Komplexbildung. 6 Alternativ ebenso wurden 12 Darüber hinaus hat gezeigt , verbesserte proteolytischen Spaltung wurde, offenen Rohr Kapillaren mit immobilisierten Enzymen entwickelt., unter Verwendung von gesteuerten Mikrowellenbestrahlung 13 oder druckunterstützten oder Druckzyklisierung Technologie (PCT) zur Verringerung der Reaktionszeiten auf 30-120 min. 14
Trotz der vielen Vorteile von immobilisierten Enzymreaktoren, die die Kosten der kommerziellen Patronen hoch ist, die Verfügbarkeit von Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Routineanwendung ist begrenzt, und die Verwendung von Mikrowellen- oder PCT Technologien führt Notwendigkeit zusätzlicher Instrumentierung. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zu entwickeln, die circumvezur Durchführung einer enzymatischen Spaltung von Proteinen in der Vorbereitung für MS-Analyse innerhalb von Minuten ngen diese Nachteile, und das kann leicht in jedem Labor durchgeführt werden Forscher mit einem einfachen und effektiven Ansatz zu stärken. Der Ansatz beruht auf der Verwendung von hydrophoben, C18-Teilchen, die in einer Kapillare oder mikrofluidische Vorrichtung vorbelastet sind, und die Adsorption des Protein (e) von Interesse auf den Teilchen durch enzymatischen Verdau während der Infusion des Enzyms über den gefolgten gepackte Bett und nahm Protein (e). In diesem Ansatz wird das Substrat durch nicht-kovalente Wechselwirkungen immobilisiert sind, und das Enzym wird über das immobilisierte Protein infundiert. Die proteolytische Verdauung Effizienz wird durch die große Partikeloberfläche Bereichen erhöht, die das Protein für die enzymatische Verarbeitung, reduzierte Abstände und Diffusionszeiten zu und von der Oberfläche der Teilchen, verbesserte Massenübertragung, keine kovalente Bindung belichten, die die Aktivität des Enzyms beeinflussen können, die Fähigkeit, schnell evaluate Kombinationen verschiedener Enzyme, Entsorgbarkeit und Multiplexen, wenn das Verfahren in einem mikrofluidischen Format ausgeführt. Dieser Ansatz wird unter Verwendung einer Mischung von Standardproteinen und Trypsin-das am häufigsten verwendete Enzym für proteolytischen Verdau vor der ESI-MS-Detektion nachgewiesen. Das Massenspektrometer zur Detektion in dieser Studie verwendet wurde, war eine lineare Quadrupol-Falle (LTQ) -Instrument.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Mikroreaktor in dieser Arbeit beschriebenen bietet eine einfach zu implementierende Versuchsaufbau zur Durchführung einer enzymatischen Verdauung der Proteine MS-Analyse und Identifizierung in weniger als 30 min zu ermöglichen. Die klaren Vorteile dieses Systems im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, sind Einfachheit, Geschwindigkeit, niedrige Reagenzienverbrauch und niedrige Kosten. Insbesondere gibt es keine Notwendigkeit für teure immobilisiertem Trypsin Perlen und Patronen. Die Herstellung der Kapill…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Referências
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