플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
질량 분석 (MS)의 대부분은 단백질 분석 방법은 일반적으로 트립신, 검출 효소 분해 단계 전에 수반 기반. 이 단계는 질량 분석 기기의 유효 주사 범위 내에 MW <3,000-4,000 다 함께 일반적으로 분자량이 작은 펩타이드의 생성을 위해 필요하다. 종래의 프로토콜은 37 ºC에서 O / N 효소 소화를 포함한다. 최근 발전은 전형적으로 예를 들면, 전자 렌지 나 고 고정화 효소 또는 몇 분에 단백질 가수 분해에 필요한 시간을 단축 상보 물리적 처리 (범위의 마이크로 리액터의 이용을 포함하는 다양한 전략의 개발을 주도 압력). 본 연구에서는 단백질을 빠르게 분해 효소를 달성하기 위해 임의의 실험실에서 구현 될 수있는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단백질 (또는 단백질의 혼합물)은 결합 된 C18 역상 높은 퍼포에 흡착모세관 컬럼에서 사전로드 된 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 실리카 입자를 필요치 않는, 수성 완충액 트립신은 짧은 시간 동안 입자를 통해 주입된다. 온라인 MS 검출을 사용하려면 트립신 펩티드는 MS 이온 소스에 직접 증가 유기물 함량과 용매 시스템과 용출된다. 이 방법은 고가의 고정화 효소 입자의 사용을 회피하고, 처리를 완료하는 처치를 필요로하지 않는다. 단백질 소화 완전한 샘플 분석은 각각 ~ 30 분 이하 ~ 3 분 이상으로 달성 될 수있다.
Introduction
정제 된 단백질의 동정 및 특성화 자주 MS 기술을 사용함으로써 달성된다. 단백질은 효소로 분해되고 그 펩티드는 더 간단한 주입 실험 장치를 사용하여 MS로 분석된다. 단백질 분해 소화 가장 MS 분석기의 유효 질량 범위에 속하는 작은 펩티드 단편을 생성하기 위해 필요하고, 그 용이 아미노산 서열 정보를 생성하기 위해 저 에너지 충돌 유도 된 분해를 통해 단편화 될 수있다. 절연 단백질 또는 단순 단백질 혼합물, MS 검출하기 전에 펩티드의 크로마토 그래피 분리에 대한 추가적인 필요가 없다. 25-50 펩티드의 혼합물을 용이 MS 이온 소스에 직접 주사기 펌프 시료를 주입하여 분석 할 수있다.
질량 분석 장치는 분석을 수행하고, 짧은 시간 프레임 내에서 단백질의 서열을 확인할 수있다. 현대 데이터 수집 방법과,이 프로세스는 승 달성 될 수있다몇 분 또는 초 ithin. 단시간 스케일에 대한 전체 프로세스를 완료하는 제한 요인이 단백질 분해성 분해 공정이다. 일반적으로, 이것은 수 시간에 걸쳐 수행된다 (또는 O / N) 용액에 37 ºC에서 사용한 기판 (50-100) 효소의 비를 1. 설명 된 미세 반응기 또는 시판되는 카트리지의 형태로, 분, 초, 고정화 효소의 마이크로 리액터의 효소 소화 시간을 감소시킨다. 1-6 일반적으로 효소를 공유 결합, 비 – 공유 / 물리 흡착 복합체가 고정화 형성 또는 캡슐화, 효소 처리의 -3,6- 향상된 효율으로 사용되는 큰 표면 대 부피 및 효소에 대한 기판 비. 고정화 반응기의 추가 이점은 MS 분석에서자가 분해 효소와의 간섭을 감소 효소 안정성 및 재사용 성을 향상시킬 것을 포함한다. 접근법을 이용하여 유리 또는 중합 미세 다양한 장치가 설명되었지만항체 – 항원 상호 작용에 의해 자성 비드에 고정화 효소를 이용하여, 7,8- 9는 티타니아, 알루미나 졸 – 겔 10 nanozeolites 11에 캡슐화 또는 니켈 NTA 또는 그의 태그 복합체 형성을 통해 캡처 된 금 나노 입자의 네트워크에 포획. 6 대안 고정화 효소 개방 관형 모세관도 개발되어있다. (12) 또한, 향상된 단백질 분해 절단은 30-120에 대한 반응 시간을 감소시키기위한 제어 마이크로파 조사 (13) 또는 압력 보조 또는 압력 사이클링 기술 (PCT)을 사용하여 입증되었다 분. (14)
고정화 효소 반응기의 여러 장점에도 불구하고, 상업적 카트리지의 비용이 높고, 일상적인 사용을위한 미세 유체 장치의 유용성은 제한되어, 추가 계측을 필요로하는 전자 또는 PCT 기술 결과의 용도. 이 연구의 목적은 circumve 방법을 개발했다이러한 단점을 NTS, 그것은 쉽게 분 이내 MS 분석에 대비 단백질의 효소 적 분해를 수행하기위한 간단하고 효과적인 방법으로 연구자 강화할 각 실험실에서 구현 될 수있다. 접근법은 모세관 또는 미세 유동 장치에 사전로드 된 소수성 C18 입자의 사용에 의존하며 통해 효소의 주입 중에 효소 분해 한 다음 이들 입자에 관심 단백질 (들)의 흡착 충전 층 및 캡처 단백질 (들). 이 방법에서, 기판은 비 – 공유 상호 작용을 통해 고정되고, 상기 효소가 고정화 된 단백질을 통해 주입된다. 단백질 분해 소화 효율을 효소 처리, 환원 및 입자의 표면으로부터의 거리와, 확산 시간은 단백질을 노출 큰 입자 표면적이 증가 질량 전사 효소의 활성에 영향을 미칠 수없는 공유 결합, 기능 향상 빠르게 evaluat다른 효소 처리 성 및 다중화 E의 조합이 과정은 미세 형식으로 실행되는 경우. 이 방법은 표준 단백질 및 ESI-MS 검출 이전에 단백질 분해 소화 트립신 가장 일반적으로 사용되는 효소의 혼합물을 이용하여 설명된다. 본 연구에 사용 된 검출 질량 분석기는 선형 트랩 중극 (LTQ)기구이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품에서 설명하는 마이크로 반응기가 제공하는 간편한 구현 미만 30 분에서 MS 분석 및 식별을 가능하게하는 단백질의 효소 소화를 수행하기위한 실험 장치를. 기존의 방법에 비해이 시스템의 뚜렷한 장점은 단순성, 속도, 낮은 시약 소모와 낮은 비용을 포함한다. 특히, 고가의 트립신 고정화 비드 카트리지가 필요 없다. 모세관 마이크로 리액터의 제조는 간단 (도 1a), 그리고 통상…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Referências
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