Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Summary

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Abstract

As células primárias são derivadas directamente a partir de tecidos e pensa-se ser mais representativo do estado fisiológico das células in vivo do que as linhas de células estabelecidas. No entanto, as culturas de células primárias geralmente têm um tempo de vida finito e precisa de ser frequentemente restabelecida. Os fibroblastos são uma fonte facilmente acessível de células primárias. Aqui, discutimos um procedimento experimental simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. O protocolo pode ser utilizado para estabelecer culturas de fibroblastos primários de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias. Quando o protocolo seguido é cuidadosamente, as contaminações não são susceptíveis de ocorrer, apesar da utilização de tecido não-estéril armazenada por tempo prolongado, em alguns casos. Os fibroblastos proliferam rapidamente em cultura e pode ser expandido para um número substancial antes de se submeter a senescência replicativa.

Introduction

As células primárias são derivadas a partir de tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro. Geralmente assume-se que as células primárias mais se assemelham ao estado fisiológico e o fundo genético do tecido a partir do qual foram produzidos de linhas de células imortalizadas ou de tumor ^1. Por essa razão, as células primárias representam um modelo útil para o estudo biológico perguntas ^2,3. No entanto, ao contrário de linhas celulares estabelecidas que crescem indefinidamente, células primárias, eventualmente, submetidos a senescência em cultura e têm de ser frequentemente restabelecida.

Células primári....

Protocol

Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em conformidade com as diretrizes institucionais, até a eutanásia (The Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações na Universidade Nacional de Cingapura e do Comité Consultivo Nacional para a Research Laboratory Animal (NACLAR) orientações).

1. Ratos

1. Peça um rato do fundo genético apropriado. Este protocolo baseia-se em tecido derivado de uma C57BL / 6 mouse.

2. Preparação de Meio Completo

1. Prepare meio completo, adicionando as seguintes componentes a Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640: 10% de soro fetal de vitelo (FCS), ....

Results

Extracção de fibroblastos a partir de resultados de tecidos em uma quantidade significativa de restos de tecido (Figura 1). Em contraste com os restos de tecido, fibroblastos de tecidos aderir às superfícies de cultura de plástico entre o dia 1 e 3 de cultura. O meio de cultura de fibroblastos pode ser alterado de forma segura no dia 3 de cultura, o qual deve diminuir significativamente os níveis de detritos presentes na cultura (Figura 2). Fibroblastos exibir uma morfologia alongada e .......

Discussion

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental simples, barato e rápido para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. A extracção deve resultar em fibroblastos aderentes dividem rapidamente e dentro de 3 dias após o isolamento do tecido. Uma importante limitação de pilhas é senescência, uma parada do crescimento permanente ^15. Usando o protocolo, culturas de fibroblastos podem ser passadas durante 5 a 6 vezes antes de se tornar fibroblastos senescentes, indicado pelo achat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Soro Fetal de Bezerro	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagina	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamina	Sigma-Aldrich	G8540
Penicilina/Estreptomicina	HyClone	SV30010
Etanol	Merck Millipore	107017	Absoluto para análise
Colagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	De Clostridium histolyticum, liofilizado, não estéril
Pronase protease	Merck Millipore	53702	De Streptomyces griseus  < / em>
Tampão Tris (pH 8)	1ª BASE	1415	Grau ultra puro
0,5M EDTA (pH 8)	1ª BASE	BUF-1053	Grau de biotecnologia
10X Fosfato tamponado salino (PBS)	1ª BASE	BUF-2040-10X4L	de grau ultra puro
10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0,5% de tripsina, 0,2% de EDTA, tripsina gama irradiada pelo processo SER-TAIN, sem vermelho de fenol, em solução salina
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μ g/ml em água deionizada, Tesoura Filtrada Estéril
	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μ Filtro de seringa M	Sartorius Stedim	16534
70 μ Filtro de células M	SPL	93070
Êmbolo de seringa	Terumo	SS+10L
Tubo criogênico	NUNC	368362
Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
Placa de cultura de células de 10 cm	Greiner	664160	Placa tratada para cultura de células
Tubo inferior cônico de 15 ml	Greiner	188271
Tubo inferior cônico de 50 ml	Greiner	227261
Banho-maria	GFL	1002
Centrífuga	Eppendorf	5810R
Agitador de incubação	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 microscópio de luz	Carl Zeiss AG