ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
فن إنتاج البروتينات المؤتلف مع بعض التعديلات بعد متعدية معقدة يمثل تحديا كبيرا للدراسات البنية والوظيفة. إنشاء السريع واسترداد عالية من خطوط الخلايا الثديية عابر.، ويتناول هذا الحاجز ويشكل وسيلة فعالة للتعبير عن البروتينات التي يتم توجيهها بشكل طبيعي من خلال ER ومسار إفرازية بوساطة جولجي. هنا هو بروتوكول واحد للتعبير البروتين باستخدام HEK293F البشرية وخطوط الخلايا HEK293S مع transfected متجه التعبير الثدييات مصممة لعوائد عالية من البروتين. مدى انطباق هذا النظام كما يتجلى ذلك باستخدام ثلاثة بروتينات سكرية التمثيلية التي أعربت عن ذات العوائد بين 95-120 ملغ من البروتين المنقى تعافى للتر الواحد من الثقافة. هذه البروتينات هي FcγRIIIa البشرية وsialyltransferase الفئران α2-6، ST6GalI، سواء أعرب مع GFP الانصهار N-محطة، وكذلك الغلوبولين المناعي البشري معدلة G1 لكرة القدم. هذا النظام يده قويةlizes وسيلة خالية من المصل التي هي قابلة للتكيف للتعبير عن البروتينات والكربوهيدرات للدراسات الهيكلية باستخدام مطياف الكتلة والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي المخصب نظائريا. وعلاوة على ذلك، تكوين N-غليكان يمكن ضبطها من خلال إضافة جزيء صغير لمنع بعض التعديلات غليكان بطريقة لا يقلل من العائد.
Introduction
إنتاج غلة عالية من البروتينات البشرية مطوية بشكل مناسب وبعد translationally معدلة لتحليل مفصل للبنية ووظيفة لا يزال يشكل تحديا كبيرا. تتوفر التي تنتج البروتينات المؤتلف مع مثل مواطن وظيفة والسلوك وهناك عدد كبير من أنظمة التعبير. أنظمة التعبير البكتيرية، في الغالب سلالات الإشريكية القولونية، تمثل الأدوات التي يمكن الوصول إليها والتي يشيع استخدامها في المجال البحثي، نظرا لبساطة هذه الأنظمة التعبير، على الرغم من الخميرة، والنباتات والحشرات والثدييات أنظمة موصوفة 1-4 أيضا. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم غير قادرة على تعديل ما بعد متعدية المناسب من البروتينات المستهدفة. A المصالح الأساسية للمختبرات اذع والوفل تنتج بروتينات حقيقية النواة مع بالغليكوزيل المناسب. العديد من البروتينات البشرية تتطلب بالغليكوزيل المناسب للوظيفة المناسبة (انظر 5).
في حقيقية النواةماكينات بالغليكوزيل واسعة النطاق وقادرة على صنع مجموعة متنوعة من التعديلات، بما في ذلك الأسباراجين (N) – وسيرين / ثريونين (O) -linked glycans معقدة 6. ويقدر أن> 50٪ من البروتينات البشرية هي N-الغليكوزيلاتي 7. Glycans هي عناصر أساسية في العديد من البروتينات بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية، إرثروبويتين، وعوامل تخثر الدم مثل عامل التاسع، على سبيل المثال لا الحصر. على الرغم من وجود طرق متعددة لتحضير البروتينات بشكل مناسب N-الغليكوزيلاتي وتتراوح الاصطناعية بحتة 10/08، لchemoenzymatic 11-14 أو التعافي من أنظمة المؤتلف المهندسة 15-20، وليس من المستغرب، ونظم التعبير الإنسان وقد ثبت حتى الآن أن يكون أكثر قوة طرق لتوليد بروتينات بشرية.
ويتم إنتاج العديد من بروتينات سكرية الإنسان العلاجية في أنظمة المؤتلف باستخدام خلايا الثدييات. نظم المذكرة هي الهامستر المبيض الصينية (CHO)، والماوس المايلوما (NS0)، بيبي الهامستر Kidneص (BHK)، الجنينية البشرية الكلى (HEK-293) وخطوط الخلايا في شبكية العين البشرية التي يعملون في الالتصاق أو التعليق الثقافة لإنتاج البروتين 4،21،22. ومع ذلك، فقد يتطلب أنظمة تعبير البروتين الثدييات جيل من خطوط الخلايا مستقرة، وسائط النمو مكلفة والركيزة ساعدت إجراءات ترنسفكأيشن 23.
ويتحقق ترنسفكأيشن الخلية الثديية بمساعدة العديد من العوامل بما في ذلك الفوسفات الكالسيوم 24،25، والبوليمرات الموجبة (DEAE-ديكستران، polybrene، متعدد الليزين، polyethylimine (PEI)) أو الجسيمات الشحمية الموجبة موجبة الشحنة 26-29. PEI هو polycationic، اتهم، خطي أو البوليمر تشعبت (25 كيلو دالتون) 26 الذي يشكل مجمع مستقرة مع DNA وendocytosed. على تحمض الاندوسوم، ويعتقد PEI للتضخم، مما أدى إلى تمزق الإندوسومات والإفراج عن الحمض النووي في السيتوبلازم 26،30.
حتى وقت قريب، ترنسفكأيشن عابرة في suspensiعلى الثقافة كان يحملها الحمض النووي / PEI تشكيل معقد مسبق يليه بالإضافة إلى زراعة الخلايا 29. ومع ذلك، ذكرت ورم وزملاء العمل بروتوكول كفاءة عالية الأمثل لإنتاج البروتين المؤتلف في الخلايا HEK293 التي شكلت مجمع DNA / جزيرة الأمير إدوارد في الموقع 31،32. تجنب هذا الإعداد والتعقيم للمجمع، وتبادل عازلة في مستنبت. مزيد من التحسين من قبل بما في ذلك البلازميدات المعززة للتعبير أدى إلى زيادة العائد الكبير 33. هنا هو الطريقة التي يبني عليها هذه السلف وغير قابلة للتطبيق على نطاق واسع. ويمكن أيضا أن تتغير الظروف التعبير للتأثير على تكوين-N غليكان.
خط الخلية HEK293S، مع حذف الجينات التي توقف تجهيز N-غليكان في مرحلة وسيطة، ويؤدي إلى التعبير عن البروتينات مع الزي N-glycans يتكون من 2 بقايا N-acetylglucosamine بالإضافة إلى خمسة بقايا المانوز (مان 5 GlcNAc 2) 34، 35. هذه الخلاياتفتقر إلى ترانسفيراز N-acetylglucosaminyl I (GntI) الجين الذي هو مطلوب للالمصب-N غليكان معالجة 36،37. استخدام مثبطات ناقلة الغليكوزيل بما في ذلك kifunensine، النظير الحامض اللعابي وفوكوسي التناظرية و2-ديوكسي-2-الفلورية فوكوسي له تأثيرات وحدود المعالجة N-غليكان 38-41 مماثلة.
ذكرت بروتوكول هنا يستخدم ناقل pGEn2 كما هو مبين في الشكل 1 42،43، PEI بمساعدة ترنسفكأيشن عابرة إلى خطوط خلايا الثدييات (HEK293F أو خلايا HEK293S)، واسترداد عوائد عالية من البروتين الغليكوزيلاتي بشكل مناسب. هذا النظام هو قوي ويمكن أن تستوعب عوامل مختلفة بما في ذلك وضع العلامات النظائر والهندسة غليكان لإنتاج التتر كبيرة من البروتينات المؤتلف.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا البروتوكول البروتين التعبير عبر ترنسفكأيشن عابرة من الخلايا HEK293F أو S. شروط ترنسفكأيشن المثلى التي أنشئت في اذع والوفل مختبرات توظف مزيجا ينتقد تركيز كثافة الخلايا وكاشف لتحقيق عالية الكفاءة ترنسفكأيشن. الاعتبارات الهامة عند تنفيذ هذا البروتوكول ما يلي: ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل ماليا من المنح K22AI099165 (AWB)، P41GM103390 (KWM) وP01GM107012 (KWM) من المعاهد الوطنية للصحة، وبأموال من روي J. زارة كارفر الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة ولاية ايوا . مضمون هذا العمل هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للالمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
Referências
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
- Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
- Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
- Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
- Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
- Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
- Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
- Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
- Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
- Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
- Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
- Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
- Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
- Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
- Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
- Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
- Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
- Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
- Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
- Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
- Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
- Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
- Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Bioquímica. 51 (22), 4618-4626 (2012).
- Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
- Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Bioquímica. 48 (41), 9705-9707 (2009).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
- Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
- Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
- Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
- Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Bioquímica. 54 (2), 313-322 (2015).
