High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
L'arte di produrre proteine ricombinanti con complesse modificazioni post-traslazionali rappresenta una sfida importante per gli studi di struttura e funzione. L'istituzione rapida ed elevata recupero da linee cellulari di mammiferi transiente transfettate indirizzi questa barriera ed è un mezzo efficace per esprimere le proteine che sono naturalmente incanalati attraverso l'ER e Golgi-mediata via secretoria. Qui è un protocollo per l'espressione della proteina con il HEK293F umano e linee cellulari HEK293S transfettate con un vettore di espressione di mammifero progettato per rese elevate di proteine. L'applicabilità di questo sistema è dimostrata utilizzando tre glicoproteine rappresentative che hanno espresso con rese tra 95-120 mg di proteina purificata recuperato per litro di cultura. Queste proteine sono la FcγRIIIa umana e sialyltransferase α2-6 ratto, ST6GalI, sia espressa con una fusione GFP N-terminale, così come la immunoglobulina umana non modificato G1 Fc. Questo robusto sistema utilizes un mezzo privo di siero che è adattabile per l'espressione di proteine e carboidrati per studi strutturali mediante spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare isotopicamente arricchiti. Inoltre, la composizione della N-glicani può essere regolato aggiungendo una piccola molecola di evitare talune modifiche glicani in modo che non riduca la resa.
Introduction
Produrre rese elevate di proteine umane opportunamente piegati e post-traduzionali modificati per l'analisi dettagliata della struttura e della funzione rimane una sfida significativa. Un gran numero di sistemi di espressione sono disponibili che producono proteine ricombinanti con funzione e il comportamento di tipo nativo. Sistemi di espressione batterici, prevalentemente ceppi Escherichia coli, rappresentano gli strumenti più accessibili e più comunemente utilizzati in ambito di ricerca, grazie alla semplicità di questi sistemi di espressione, però lieviti, piante, insetti e mammiferi sono anche descritti 1-4. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi sono incapaci di appropriate modificazione post-traduzionale di proteine bersaglio. Un interesse fondamentale dei laboratori Barb e Moremen sta producendo proteine eucariotiche con un'adeguata glicosilazione. Molte proteine umane richiedono glicosilazione appropriato per il corretto funzionamento (vedi punto 5).
Il eucarioticamacchine glicosilazione è ampia e in grado di fare una vasta gamma di modifiche, tra cui sia asparagina (N) – e serina / treonina (O) linked glicani complessi 6. Si stima che> 50% di proteine umane sono N-glicosilata 7. Glicani sono componenti essenziali di molte proteine, tra cui gli anticorpi monoclonali terapeutici, eritropoietina, e fattori di coagulazione del sangue come fattore IX, per citarne alcuni. Anche se esistono diversi metodi per preparare adeguatamente le proteine N-glicosilata e vanno dal puramente sintetica 8-10, a chemoenzimatica 11-14 o il recupero dai sistemi ricombinanti ingegnerizzati 15-20, non a caso, sistemi di espressione umane hanno finora dimostrato di essere il più robusto metodi per generare proteine umane.
Molti glicoproteine umani terapeutiche sono prodotte in sistemi ricombinanti utilizzando cellule di mammifero. Sistemi di nota sono l'ovaio di criceto cinese (CHO), mouse mieloma (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), embrionale umano Rene (HEK-293) e linee di cellule retiniche umane che sono impiegati in adesione o la sospensione di coltura per la produzione di proteine 4,21,22. Tuttavia, sistemi di espressione di proteine di mammifero hanno richiesto la generazione di linee cellulari stabili, terreni di crescita costosi e substrato assistita procedure di trasfezione 23.
Trasfezione di cellule di mammifero è realizzato con l'ausilio di numerosi agenti, tra cui fosfati di calcio 24,25, polimeri cationici (DEAE-destrano, polibrene, polilisina, polyethylimine (PEI)) o caricati positivamente liposomi cationici 26-29. PEI è un policationico, carica, lineare o ramificato polimero (25 kDa) 26 che forma un complesso stabile con il DNA ed è endocitosi. Dopo acidificazione del endosome, PEI è pensato a gonfiarsi, portando alla rottura di endosomi e liberazione del DNA nel citoplasma 26,30.
Fino a poco tempo, trasfezione transiente in suspensisulla cultura è stata effettuata previo formazione del complesso DNA / PEI seguita tramite aggiunta alla coltura cellulare 29. Tuttavia, Würm e collaboratori hanno riportato un protocollo altamente efficiente ottimizzato per la produzione di proteine ricombinanti in cellule HEK293 che formavano un complesso DNA / PEI in situ 31,32. Ciò ha evitato preparazione, sterilizzazione del complesso, e scambio di tamponi in un terreno di coltura. Ulteriore ottimizzazione includendo plasmidi di espressione di miglioramento ha portato ad aumenti di rendimento significativo 33. Qui è un metodo che si basa su questi progressi ed è ampiamente applicabile. Condizioni di espressione può anche essere modificati per influenzare la composizione N-glicani.
La linea cellulare HEK293S, con una delezione del gene che blocca trasformazione di N-glicani in una fase intermedia, porta alla espressione di proteine con uniformi N-glicani composto da 2 residui N-acetilglucosamina più cinque residui di mannosio (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Queste cellulemanca la transferasi N-acetylglucosaminyl I (GntI) gene che è richiesto per N-glicani lavorazione a valle 36,37. L'uso di inibitori glicosiltransferasi compreso kifunensine, analoghi di acido sialico e fucosio analogico e 2-deossi-2-fluoro-fucosio ha effetti simili e limiti di lavorazione N-glicani 38-41.
Il protocollo qui riportato utilizza il vettore pGEn2 come mostrato in Figura 1 42,43, PEI assistito trasfezione transiente in cellule di mammifero (linee HEK293F o cellule HEK293S), e il recupero di alte rese di proteine opportunamente glicosilata. Questo sistema è robusto e può ospitare diversi fattori tra cui marcatura isotopica e l'ingegneria glycan per la produzione di grandi titoli di proteine ricombinanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo illustra l'espressione della proteina tramite la trasfezione transiente di cellule HEK293F o S. Le condizioni ottimali di trasfezione stabilite nei laboratori Barb e Moremen utilizzano una combinazione critica di concentrazioni di densità delle cellule e reagenti per ottenere un'elevata efficienza di trasfezione. Considerazioni critiche in sede di attuazione di questo protocollo sono: il mantenimento di una cultura stabile prima di trasfezione (con la cultura coerente tempi raddoppio); trasfez…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dal National Institutes of Health, e da fondi del Roy J. Carver Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare presso la Iowa State University . Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
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