High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
Искусство получения рекомбинантных белков со сложными пост-трансляционных модификаций представляет собой серьезную проблему для исследований структуры и функции. Быстрое создание и высокое извлечение из временно трансфецированных клеточных линий млекопитающих обращается этот барьер и является эффективным средством выражения белки, которые, естественно, направлен через ER и Гольджи-опосредованной секреторной пути. Вот один протокол для экспрессии белка с использованием человеческого и HEK293F HEK293S клеточные линии, трансфицированные экспрессирующий вектор млекопитающего, предназначенный для высоких урожаев белка. Применимость этой системы продемонстрировали с помощью трех представительных гликопротеинов, которые выразили при урожайности между 95-120 мг очищенного белка восстановленного на литр культуры. Эти белки являются человеческий FcγRIIIa и крыс α2-6 сиалилтрансферазу, ST6GalI, как выражается с N-концевой GFP слияния, а также немодифицированного человеческого иммуноглобулина G1 Fc. Это надежные системы ИМПlizes бессывороточной среды, что является гибкой для выражения изотопно обогащенных белков и углеводов для структурных исследований с использованием масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Кроме того, в состав N-гликанов может быть настроена путем добавления небольшого молекулу, чтобы предотвратить определенные модификации гликанов таким образом, чтобы не уменьшить выход.
Introduction
Производство высокие урожаи соответствующим сложенными и посттрансляционно модифицированных белков человека для детального анализа структуры и функции остается серьезной проблемой. Большое количество систем экспрессии доступны, которые производят рекомбинантные белки с нативной как функции и поведение. Бактериальные системы экспрессии, преимущественно кишечной палочки штамма, представляют собой наиболее доступных и широко используемых инструментов в научно-исследовательской сфере, в связи с простотой этих систем экспрессии, хотя дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих систем также описаны 1-4. Тем не менее, большинство из этих систем не способны соответствующим посттрансляционной модификации белков-мишеней. Фундаментальный интерес лабораториях Барб и Moremen производит эукариотических белков с соответствующей гликозилирования. Многие белки человека требуют соответствующего гликозилирования для правильного функционирования (см 5).
Эукариотическийгликозилирования техника обширна и способны сделать широкий спектр модификаций, в том числе как аспарагин (N) – и серина / треонина (О) -связанной сложные гликаны 6. Считается, что> 50% человеческих белков N-гликозилированные 7. Гликаны являются важными компонентами многих белков, включая терапевтические моноклональные антитела, эритропоэтин, и факторов свертывания крови, как фактор IX, чтобы назвать несколько. Хотя несколько методов существуют, чтобы подготовить соответствующим образом N-гликозилирования белков и варьируются от чисто синтетических 8-10, чтобы chemoenzymatic 11-14 или восстановление из инженерных рекомбинантных системах 15-20, не удивительно, что системы человека выражение до сих пор доказано, что самый надежный методы для генерации человеческих белков.
Многие терапевтические человека гликопротеины производятся в рекомбинантных системах, использующих клетки млекопитающих. Системы следует отметить яичника китайского хомячка (СНО), мышиной миеломы (ns0), хомячка Kidneу (ВНК), человеческого эмбриона почек (НЕК-293) и сетчатки клеточных линий человека, которые используются в адгезии или суспензионной культуры для производства белка 4,21,22. Тем не менее, системы экспрессии белка млекопитающего требовали генерацию стабильных клеточных линий, дорогих питательной среды и подложки помощь процедур трансфекции 23.
Млекопитающих трансфекции клеток достигается с помощью многочисленных агентов, включая фосфатов кальция 24,25, катионных полимеров (DEAE-декстран, полибрен, полилизин, polyethylimine (PEI)) или положительно заряженных катионные липосомы 26-29. PEI является поликатионное, загружают, линейный или разветвленный полимер (25 кДа), который формирует 26 стабильный комплекс с ДНК и эндоцитоз. При подкислении эндосомы, PEI, как полагают, набухают, что приводит к разрыву эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму 26,30.
До недавнего времени, временная трансфекция в suspensiна культуру проводилась по предварительной ДНК / PEI комплексообразования с последующим добавлением к культуре клеток 29. Тем не менее, Würm и соавторы сообщили весьма эффективный протокол, оптимизированный для рекомбинантного белка в клетках НЕК293, которые сформировали комплекс ДНК / PEI в месте 31,32. Это препарат, избежать стерилизации комплекса, и буфера обмена в культуральной среде. Дальнейшая оптимизация путем включения экспрессии плазмиды, повышающих привели к значительным увеличением доходности 33. В этом метод, который основывается на этих авансов и широко применим. Условия экспрессии также могут быть изменены, чтобы повлиять на состав N-гликанов.
Клеточная линия HEK293S, с делеции гена, что останавливает N-гликана обработки на промежуточном этапе, приводит к экспрессии белков с единых N-гликанов, состоящих из 2 N-ацетилглюкозамина остатков плюс пять остатков маннозы (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Эти клеткине хватает N-ацетилглюкозаминил трансферазы I (GntI) ген, который требуется для последующего N-гликанов обработки 36,37. Применение ингибиторов гликозилтрансферазы включая kifunensine, аналогов сиаловой кислоты и фукозы аналоговых и 2-дезокси-2-фтор-фукозы имеет подобные эффекты и ограничения N-гликанов обработки 38-41.
Протокол сообщалось здесь, использует вектор pGEn2, как показано на рисунке 1 42,43, PEI трансфекции помощь переходные в клетки линий (HEK293F или HEK293S клеток), а также восстановление с высоким выходом соответственно гликозилированный белок. Эта система является надежной и может использоваться для различных факторов, включая изотопной метки и гликановой техники для производства больших титров рекомбинантных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол иллюстрирует экспрессию белка с помощью переходного трансфекции HEK293F или S клеток. Оптимальные условия трансфекции, установленные в лабораториях Барб и Moremen использовать критическую комбинацию плотности клеток и реагентов концентрации для достижения высокой эффективн?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при финансовой поддержке грантами K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) и P01GM107012 (KWM) из Национального института здоровья, и средств от Роя Дж Carver Департамента биохимии, биофизики и молекулярной биологии в Университете штата Айова , Содержание данной работы является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
Referências
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
- Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
- Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
- Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
- Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
- Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
- Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
- Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
- Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
- Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
- Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
- Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
- Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
- Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
- Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
- Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
- Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
- Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
- Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
- Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
- Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
- Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
- Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Bioquímica. 51 (22), 4618-4626 (2012).
- Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
- Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Bioquímica. 48 (41), 9705-9707 (2009).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
- Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
- Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
- Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
- Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Bioquímica. 54 (2), 313-322 (2015).
