מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
הבנה מקיפה של מסלולי איתות דורשת ידע מפורט על האינטראקציה ליגנד לרצפטור. רוב השיטות להערכת האינטראקציה של ליגנד מסוים עם קולטן המסוים שלה הם יקרים, זמן רב, עבודה אינטנסיביות דורשות ציוד ספציפי ומומחיות 1.
מאמר זה מתאר שני מהירים ואמין, נקודה אחר נקודת פרוטוקולים לחקור את אינטראקצית הקולטן ליגנד המבוססת על אנזים מקושר assay immunosorbent (ELISA): את assay האינטראקציה ליגנד לרצפטור הישירה (LRA) ואת LRA התחרות. ELISA היא טכניקה רגישה, מאוד ספציפית וזמינה, בשימוש שגרתי כמעט בכל מעבדה. ELISA יכול להתבצע ומותאם באופנה שונה. הפרוטוקולים שהוצגו ממוטבים עבור חקירת האינטראקציה בין אינטרפרונים למבדה שונים (INFLs) והקולטן שלהם.
לצבא LRA הישיר מאפשר quantificatiעל של קולטן ליגנד מחייב ביחס ריכוז ליגנד ובכך מניב עקום מחייב. באמצעות מודל מתאים האינטראקציה ליגנד לרצפטור, הנתונים ניתן לנתח עוד יותר להעריך את קבוע דיסוציאציה (K D).
בפרוטוקול שהוצג, משוואת היל הנפוצה מוחל מודל קולטן ליגנד מחייב. למרות שיטות אחרות כגון טכנולוגיית תהודת plasmon המשטח 2,3 לאפשר קביעת הזיקות המחייבות בין שני חלבונים, טכנולוגיה זו היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, יקרה, ודורשת ציוד מעבדה מיוחד.
לצבא LRA התחרות מאפשר הקרנת פפטידים מעכבים: קולטן ליגנד המחייב הוא לכימות ביחס ריכוז הפפטיד. זה מניב עקומת מנה-תגובה המתאר את ההשפעה המעכבת של הפפטיד. הנתונים ניתן לנתח עוד יותר להעריך את ריכוז מעכבות מקסימלי וחצי (IC 50 </sub>) של הפפטיד החסימה.
שני פרוטוקולי ELISA קלים לשימוש וניתן להתאים למגוון רחב של שאלות מחקר. חלבונים רקומביננטי מכל סוג שהוא יכול לשמש באופן מהימן ומהיר לקבוע מהם חלקי אינטראקציה. בנוסף, LRA התחרות יכול לשמש כדי לקבוע אתרי אינטראקציה קריטיים של הליגנדים ואת הקולטנים באמצעות פפטידים חסימה, אשר נועדו לחקות או ליגנד או הקולטן. אם הפפטיד חסימת מראה עיכוב יעיל וספציפי, הפפטיד תופסת אתר אינטראקציה קריטי של ליגנד (אם הפפטיד מחקה הקולטן) או של ליגנד (אם הפפטיד מחקה ליגנד).
הפרוטוקול הראשון מתאר את נחישות ערך D K של INFLs השונה למקטע אלפא של הקולטן שלהם, כלומר, הקולטן interleukin-28 (IL28RA) באמצעות LRA הישיר. לאחר מכן, בפרוטוקול השני מראה כיצד לקבוע את היכולת של פפטיד ארוך חומצה 20 אמינולעכב את האינטראקציות INFL-IL28RA. הפפטיד נועד להתחרות עם IFNLs באתר מחייב הקולטן שלהם ובכך מאפשר הבנה מולקולרית של האינטראקציה. יתר על כן, פפטיד זה יכול לשמש כדי לחסום IL28RA בניסויים במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה על במורד איתות אפקטים 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA הוא תקן ושיטה ומבוססת למעבדות רבות. יש לנו שונה נוספים ושיפרנו 5,7 שיטה שפורסמו בעבר. צעד אחר צעד הפגין הפרוטוקול מראה כיצד ניתן להשתמש בו בצורה פשוטה כדי לקבוע את ערכי D K של אינטראקציות ליגנד לרצפטור. בנוסף, IC50 של פפטיד חסימת מפריע האינטראקציה ליגנד לרצ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Referências
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Bioquímica. 35, 6786-6794 (1996).
