ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
シグナル伝達経路の包括的な理解は、リガンド – 受容体相互作用についての詳細な知識が必要です。その特定の受容体と特定のリガンドとの相互作用を評価するためのほとんどの方法は、高価な、時間がかかり、労働集約的であり、特定の機器と専門知識1を必要とします 。
直接リガンド – 受容体相互作用アッセイ（LRA）と競争LRA：この記事では、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）に基づいて、リガンド – 受容体相互作用を調査するために、2つの高速かつ信頼性の高いポイントバイポイントプロトコルについて説明します。 ELISAは、日常的にほとんどすべての研究室で使用される高度に敏感な特定の、容易に入手できる技術です。 ELISAを実施し、様々な様式で適合させることができます。提示プロトコルは異なるラムダインターフェロン（INFLs）とその受容体との間の相互作用の調査のために最適化されています。
直接LRAはquantificatiを可能にしますリガンド – 受容体のリガンド濃度に対して結合し、従って、結合曲線が得られます。リガンド-受容体相互作用のための適切なモデルを使用して、データは、さらに、解離定数（K D）を推定するために分析することができます。
提示されたプロトコルでは、一般的に使用されるHillの式は、リガンド – 受容体結合をモデル化するために適用されます。このような表面プラズモン共鳴技術2,3のような他の方法は、2つのタンパク質間の結合親和性の決意を可能にするが、この技術は、しばしば、労働集約的で、高価であり、特別な実験装置を必要とします。
競争LRAは、阻害ペプチドのスクリーニングを可能にします：リガンド – 受容体結合は、ペプチド濃度に対して定量化されます。これは、ペプチドの阻害効果を説明する用量応答曲線をもたらします。データはさらに、半最大阻害濃度（IC 50を推定するために分析することができます</サブ>）ブロッキングペプチド。
両方のELISAプロトコルを使用するのは簡単であり、研究課題の広い範囲に適合させることができます。任意の種類の組換えタンパク質は、確実かつ迅速な相互作用部分を決定することができます。また、競争LRAは、リガンドまたは受容体のいずれかを模倣するように設計されたブロッキングペプチドを用いて、リガンドと受容体の重要な相互作用部位を決定するために用いることができます。ブロッキングペプチドが効率的かつ特異的阻害を示した場合、ペプチドは、リガンド（ペプチド模倣受容体の場合）またはリガンド（ペプチド模倣リガンドの場合）のの重要な相互作用部位を占めています。
最初のプロトコルが異なるINFLsのK D値の決意と直接LRAを使用して、それらの受容体、 すなわち、インターロイキン28受容体（IL28RA）のαサブユニットを説明します。次に、第二のプロトコルは、20アミノ酸長のペプチドの能力を決定する方法を示していますINFL-IL28RAの相互作用を阻害します。ペプチドは、それらの受容体結合部位でIFNLsと競合するように設計され、したがって、相互作用の分子的理解を可能にします。さらに、このペプチドは、下流のシグナル伝達の効果4への影響を決定するためのin vitro実験においてIL28RAをブロックするために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISAは多くの研究室のための標準的かつ十分に確立された方法です。我々はさらに修正され、以前に発表された方法5,7を改善しています。実証ステップバイステップのプロトコルは、リガンド-受容体相互作用のK D値を決定するための簡単な方法で使用することができる方法を示しています。また、リガンド – 受容体相互作用を妨害するブロッキングペプチドのIC50を決定する?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Referências
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