Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Una comprensión completa de las vías de señalización requiere un conocimiento detallado acerca de la interacción ligando-receptor. La mayoría de los métodos para evaluar la interacción de un ligando particular con su receptor específico son caros, intensiva consume tiempo, trabajo y requieren equipo y la experiencia 1 específico.
Este artículo describe dos protocolos rápidos y fiables punto por punto para investigar la interacción ligando-receptor basado en una enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA): el ensayo de interacción ligando-receptor directo (LRA) y el LRA competencia. ELISA es una técnica altamente sensible, específica y fácilmente disponible, que se utiliza de forma rutinaria en casi todos los laboratorios. ELISA se puede realizar y adaptada de varias maneras. Los protocolos presentados están optimizados para la investigación de la interacción entre diferentes interferones lambda (infls) y su receptor.
El LRA directa permite una quantificatien de unión ligando-receptor con respecto a la concentración de ligando y por lo tanto produce una curva de unión. El uso de un modelo apropiado para la interacción ligando-receptor, los datos pueden ser analizados para estimar la constante de disociación (K D).
En el protocolo presentado, la ecuación de Hill de uso común se aplica al modelo de la unión de ligando-receptor. Aunque otros métodos tales como la tecnología de resonancia de plasmón de superficie 2,3 permiten la determinación de las afinidades de unión entre dos proteínas, esta tecnología es a menudo un trabajo intensivo, costoso y requiere un equipo especial de laboratorio.
El LRA competencia permite el cribado de péptidos inhibidores de: la unión ligando-receptor se cuantifica con respecto a la concentración de péptido. Esto produce una curva de dosis-respuesta que describe el efecto inhibitorio del péptido. Los datos pueden ser analizados para estimar la media máxima concentración inhibitoria (IC 50 </sub>) del péptido de bloqueo.
Ambos protocolos de ELISA son fáciles de usar y pueden adaptarse a una amplia gama de temas de investigación. Las proteínas recombinantes de cualquier tipo se pueden utilizar para determinar de forma fiable y rápido de las partes de interacción. Además, el LRA competencia puede ser utilizado para determinar los sitios de interacción crítica de ligandos y receptores mediante el uso de péptidos de bloqueo, que están diseñados para imitar el ligando o el receptor. Si el péptido de bloqueo muestra la inhibición eficiente y específica, el péptido se encuentra en un sitio crítico interacción del ligando (si los compuestos peptídicos miméticos del receptor) o del ligando (si los compuestos peptídicos miméticos el ligando).
El primer protocolo describe la determinación K D valor de diferentes infls y la subunidad alfa de su receptor, es decir, el receptor de la interleucina-28 (IL28RA) utilizando el directo LRA. A continuación, el segundo protocolo se muestra cómo determinar la capacidad de un péptido largo de 20 amino ácido parainhibir las interacciones INFL-IL28RA. El péptido está diseñado para competir con IFNLs en su sitio de unión al receptor y por lo tanto permite una comprensión molecular de la interacción. Además, este péptido puede ser usado para bloquear IL28RA en experimentos in vitro para determinar el impacto sobre los efectos de señalización corriente abajo 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA es un estándar y un método bien establecido para muchos laboratorios. Hemos modificado y mejorado aún más un método publicado previamente 5,7. El protocolo demostrado paso a paso muestra cómo se puede utilizar de una manera sencilla para determinar los valores K D de interacciones ligando-receptor. Además, el IC50 de un péptido de bloqueo que interfiere con la interacción ligando-receptor puede ser determinada.
Las principales ventajas son la configuraci?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Referências
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