Meiotisk Spindle Bedömning i musoocyter av siRNA-medierad Ljuddämpning
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för specifik siRNA-medierad mRNA utarmning följt av immunofluorescensanalys att utvärdera meiotisk spindelenhet och organisation i musoocyter. Detta protokoll är lämplig för in vitro utarmning av transkript och funktionell bedömning av olika spindel och / eller MTOC associerade faktorer i oocyter.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
Meios är en unik division process som sker i gameter (äggceller och spermier) och som omfattar två på varandra följande divisioner utan mellanliggande DNA-syntes att segregera homologa kromosomer och systerkromatider under meios-I och meios-II, respektive 1. Fel i kromosomsegregation under meiotisk delning i oocyter kan resultera i aneuploidi, som ärvs av embryot under befruktningen. Noterbart ökar förekomsten av aneuploidi i utvecklings embryon med stigande moderns ålder och är en viktig orsak till medfödda missbildningar samt missfall hos kvinnor 1,2, alltså, vilket understryker en viktig behov av att förstå den molekylära grunden för aneuploidi under meiotisk delning .
Under celldelning är synnerligen beroende av monteringen av mikrotubuli spindelapparaten och etablering av stabila kromosom-mikrotubuli interaktioner för korrekt anslutning till motsatt spindelkromosomsegregationstolpar. Viktigt, meiotisk spindelbildning i däggdjurs oocyter skiljer sig från mitos i somatiska celler, och regleras av unika mikrotubuli organiserande centraler (MTOCs) som saknar centrioler 3,4. Viktiga proteiner som är nödvändiga för mikrotubuli kärnbildning och organisation lokalisera till äggcell MTOCs, inklusive γ-tubulin som katalyserar mikrotubulus aggregatet. Dessutom pericentrin fungerar som en viktig byggnadsställning protein som binder och ankare y-tubulin samt andra faktorer som MTOCs 5. I synnerhet våra studier visar att utarmning av viktiga MTOC-associerade proteiner stör meiotisk spindel organisation och leder till kromosomsegregation fel i oocyter, som inte är fullt beslutas av spindelenhet checkpoint (SAC) 6,7. Därför brister i spindel stabilitet, som inte utlöser meiotiska gripande, utgör en betydande risk för att bidra till aneuploidi. Trots deras viktiga roll i spindelenhet och organisation, äggcell MTOC protein sammansättning och funktion är fortfarande dåligt kända.
Testa funktionen hos specifika målproteiner i däggdjurs oocyter är utmanande, eftersom cellerna blir transkription vilande strax före återupptagandet av meios 8,9. Därför preovulatoriska oocyter lita på moderns mRNA butiker att återuppta meios och stödja meiotisk divisionen samt första klyvnings divisionerna efter befruktningen 10,11. Effekten av RNA-interferens (RNAi) förmedlad nedbrytning av mRNA-transkript i däggdjurs ägg är väl etablerad och moderns RNA rekryteras för översättning under meiotisk mognad är särskilt mottagliga för siRNA inriktning 12-14. Därför mikroinjektion av korta störande RNA (siRNA) i oocyter ger en värdefull metod för att utarma rikt mRNA för funktionstestning.
Här beskriver vi metoder för isolering av musoocyter och siRNA-medierad utarmning av specifik transcripts att testa funktionen av en väsentlig MTOC-associerat protein, pericentrin. Dessutom beskriver vi immunofluorescensanalys förutsättningar för att utvärdera meiotisk spindelbildning i oocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan det finns flera metoder för exogen syra överföring till somatiska celler, såsom elektroporering och transfektion nuklein, är mikroinjektion den optimala metoden för leverans av RNA-molekyler i transkriptionellt vilande musoocyter. Den nuvarande protokollet ger en effektiv metod för in vitro utarmning av specifika mRNA som möjliggör funktionstestning av annan spindel och / eller MTOC associerade faktorer i oocyter. Detta synsätt leder till effektiv utskrift utarmning och är mycket anpassningsbar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Referências
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
