Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

Summary

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Abstract

Interacções proteína-proteína (IBPs) estão intimamente envolvidos em quase todos os processos biológicos e estão ligadas a muitas doenças humanas. Portanto, há um grande esforço para atingir os IPP em pesquisa básica e na indústria farmacêutica. As interfaces proteína-proteína são geralmente grande e plana, e muitas vezes não têm bolsos, o que complica a descoberta de pequenas moléculas que têm como alvo tais sites. Abordagens alternativas de segmentação utilizando anticorpos têm limitações devido à baixa biodisponibilidade oral, baixa de células-permeabilidade, e ineficiência de produção.

Usando péptidos alvo para interfaces de PPI tem várias vantagens. Os péptidos têm maior flexibilidade conformacional, o aumento da selectividade, e são geralmente baratos. No entanto, os péptidos têm suas próprias limitações incluindo a má estabilidade e ineficiência atravessar membranas celulares. Para superar estas limitações, o péptido de ciclização pode ser realizada. A ciclização foi demonstrado melhorar a selectividade peptídeo, A estabilidade metabólica e biodisponibilidade. No entanto, a previsão da conformação bioactiva de um péptido cíclico não é trivial. Para ultrapassar esta dificuldade, uma abordagem atractiva para o rastreio de uma biblioteca focada para a tela no qual todos os péptidos cíclicos da espinha dorsal tem a mesma sequência primária, mas diferem nos parâmetros que influenciam a sua conformação, como o tamanho do anel e posição.

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese de uma biblioteca de péptidos cíclicos de segmentação de estrutura de parasitas específicos de IPP. Utilizando uma abordagem de design racional, foi desenvolvido a partir de péptidos derivados do receptor de G eishmania proteína C activada para andaime-quinase (ausência). Colocámos a hipótese de sequências em FALTA que são conservadas em parasitas, mas não no homólogo de hospedeiro mamífero, podem representar sítios de interacção para proteínas que são críticas para a viabilidade dos parasitas. Os péptidos cíclicos foram sintetizados utilizando a irradiação de microondas para reduzir os tempos de reacção e aumentareficiência. O desenvolvimento de uma biblioteca de backbone peptídeos cíclicos com diferentes tamanhos de tela de toque facilita uma sistemática para a conformação activa mais biológica. Este método oferece uma maneira geral, rápido e fácil de sintetizar péptidos cíclicos.

Introduction

Interacções proteína-proteína (IBPs) desempenham um papel essencial na maioria dos processos biológicos, de transdução de sinal intracelular para a morte de células ^1. Assim, visando IPP é de fundamental importância para a pesquisa básica e aplicações terapêuticas. IPP pode ser regulada por meio de anticorpos específicos e estáveis, mas os anticorpos são caros e difíceis de fabricar e têm uma fraca biodisponibilidade. Alternativamente, IPP pode ser alvo de moléculas pequenas. As moléculas pequenas são mais fáceis de sintetizar e barata em comparação com anticorpos; no entanto, eles são relativamente menos flexível e encaixar melhor do que para as pequenas cavidades grandes para as interfaces proteína-proteína ^2,3. Diversos estudos demonstraram que os péptidos, que são mais simples e mais barata do que os anticorpos e mais flexível do que as moléculas pequenas, as interfaces de proteína pode ligar-se e regulam IPP ^4,5. O mercado global de peptídeo terapêutico foi avaliada em torno de quinze bilhões de dólares em 2013 e está crescendo 10,5% annually ^6. Além disso, existem mais do que 50 péptidos comercializados, cerca de 270 péptidos em diferentes fases de ensaios clínicos, e cerca de 400 péptidos em fases pré-clínicos avançados ^7. Apesar de numerosos peptídeos estão sendo usados ​​como drogas, peptídeos ainda representam vários desafios que limitam a sua aplicação generalizada, incluindo fraca biodisponibilidade e estabilidade, a ineficiência nas membranas celulares cruzamento, e flexibilidade conformacional ^8,9. Uma alternativa para superar estes inconvenientes é a aplicação de diferentes modificações, tais como (D-amino ácido e N-alquilação) local e global (ciclização) constrangimentos ^8,10-12. Estas alterações também ocorrem naturalmente. Por exemplo, a ciclosporina A, um péptido imunossupressor naturais cíclica, contém um único ácido aminado D e sofre modificações de N-alquilação ^13,14.

Modificação de amino ácidos naturais para induzir constrangimentos locais, tais como D e N-alquilação, muitas vezes afecta o peptídeo9; s atividade biológica. No entanto, a ciclização, na qual a sequência de interesse pode permanecer a mesma, é mais provável para preservar a actividade biológica. A ciclização é uma forma altamente atraente para restringir o espaço conformacional péptido, reduzindo o equilíbrio entre diferentes conformações. Geralmente, aumenta a actividade biológica e selectividade ao restringir o péptido para a conformação activa que medeia apenas uma função. A ciclização também melhora a estabilidade do péptido, mantendo o peptídeo numa conformação que é reconhecida pelos menos as enzimas degradantes. Com efeito, os péptidos cíclicos foram mostrados como tendo uma melhor estabilidade metabólica, biodisponibilidade, e a selectividade em relação aos seus equivalentes lineares ^15-17.

No entanto, a ciclização pode ser uma espada de dois gumes, uma vez que, em alguns casos, a restrição pode impedir que os péptidos de atingir uma conformação bioactiva. Para superar este obstáculo, uma biblioteca focada no qual todos os péptidos possuem o mesmo sequenc primárioE e consequentemente constante farmacóforos podem ser sintetizados. Os péptidos da biblioteca diferem em parâmetros que influenciam a sua estrutura, tais como o tamanho do anel e posição, a fim de rastrear, subsequentemente, para a conformação bioactiva mais ^9,18.

Os péptidos podem ser sintetizados tanto em solução como por uma abordagem de síntese de péptidos em fase sólida (SPPS), que é agora a abordagem de síntese de péptidos mais prevalente e será discutido mais adiante. SPPS é um processo pelo qual as transformações químicas são realizadas sobre um suporte sólido através de um ligante para preparar uma vasta gama de compostos sintéticos ^19. SPPS de montagem permite que os péptidos por acoplamento consecutivo de ácidos aminados de uma forma passo a passo a partir do terminal C, que está ligado a um suporte sólido, para a extremidade N-terminal. As cadeias laterais de ácido N-a-amino deve ser mascarados com grupos protectores que são estáveis ​​nas condições de reacção utilizadas durante péptido alongamento para assegurar a adição de um aminoácido por rep. No passo final, o péptido é libertado a partir da resina e a cadeia lateral de grupos protectores são removidos simultaneamente. Enquanto o péptido está a ser sintetizado, todos os reagentes solúveis podem ser removidos a partir da matriz de suporte sólida de péptido-se por filtração e lavado no final de cada passo de acoplamento. Com um tal sistema, um grande excesso de reagentes a uma concentração elevada pode conduzir a reacções de acoplamento e a conclusão de todas as etapas de síntese pode ser realizada no mesmo recipiente, sem transferência de material ^20.

Embora SPPS apresenta algumas limitações, tais como a produção de reacções incompletas, reacções secundárias, reagentes impuros, bem como dificuldades de controlo da reacção ^21, as vantagens de SPPS fez-se o "padrão de ouro" para a síntese de péptidos. Estas vantagens incluem a opção de incorporar ácidos aminados não naturais, automação, fácil purificação, perdas físicas minimizadas, e a utilização de reagentes em excesso, resultando emrendimentos elevados. SPPS demonstrou ser extremamente útil na síntese de sequências difíceis, ^21,22 modificações fluorescentes ^23, e bibliotecas de péptidos ^24,25. SPPS também é muito útil para outras montagens de cadeia poli, tais como os oligonucleótidos, oligossacáridos ^{28,29 26,27,} e ácidos nucleicos peptídicos ^30,31. Curiosamente, em alguns casos, a SPPS foi demonstrado ser vantajoso para a síntese de moléculas pequenas que são tradicionalmente feitas em solução de ^32,33. SPPS é usado tanto em pequena escala para pesquisa e ensino, bem como ^34,35 larga escala na indústria ^36-38.

Duas estratégias de síntese que são usados ​​principalmente em SPPS metodologia para a síntese de péptidos são butiloxicarbonilo (Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). A estratégia original introduzido para a SPPS Boc foi, o que requer condições fortemente ácidas para remover os grupos protectores da cadeia lateral e clivagem do péptido da resin. A síntese de péptidos de Fmoc-baseado, no entanto, utiliza condições base moderada e é uma alternativa mais leve ao protocolo Boc ácido-lábil ^39. A estratégia de Fmoc utiliza ortogonal de t-butilo (tBu) protecção da cadeia lateral que é removido no último passo da síntese, enquanto a clivagem do péptido a partir da resina sob condições ácidas.

O princípio geral para a síntese de péptidos sobre suporte sólido é apresentado na Figura 1. O aminoácido inicial, mascarada por um grupo protector temporário na N-α-terminal, é carregada sobre a resina a partir da extremidade C-terminal. Um grupo de protecção semi-permanente para mascarar a cadeia lateral é também utilizado, se necessário (Figura 1, Passo 1). A síntese do péptido alvo é montado a partir do terminal C para o terminal N de ciclos repetitivos de desprotecção do grupo de protecção N-α-temporária (Figura 1, Passo 2) e o acoplamento do aminoácido seguinte protegido (Figura 1 </str ong>, Passo 3). Após o último aminoácido está carregado (Figura 1, Passo 4), o péptido é clivado do suporte de resina e os grupos de protecção semi-permanentes são removido (Figura 1, Passo 5).

Figura 1. Esquema geral de síntese de péptidos em fase sólida. O aminoácido protegido por N-α está ancorada usando o grupo carboxilo através de um ligante à resina (Passo 1). O péptido desejado é montado de um modo linear a partir do terminal C para o terminal N de ciclos repetitivos de desprotecção do grupo de protecção temporária (TPG) a partir do N-α (Passo 2) e o acoplamento de aminoácidos (Passo 3). Após realização da síntese (Passo 4), os grupos de protecção semi-permanentes (SPG) são desprotegidos durante a clivagem do péptido (Passo 5).obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a montagem da cadeia peptídica completa, ciclização pode ser conseguido por várias alternativas: (A) head-to-tail ciclização – Esta é uma maneira conveniente, mas limitado, uma vez que fornece apenas uma opção para ciclização (Figura 2A), (B) ciclização utilizando os aminoácidos da sequência de interesse que contêm grupos funcionais bioactivos – no entanto, a utilização destes aminoácidos pode influenciar a actividade biológica (Figura 2B), e (C) a ciclização através da adição de aminoácidos (ou de outros blocos de construção), sem perturbar a sequência bioactivo. A introdução destas moléculas é generalizado, uma vez que permite a produção de bibliotecas focadas, sem modificar a sequência de interesse (Figura 2C).

Figura 2. estratégias de ciclização de péptido A alternativa (a) ciclização cabeça à cauda através de uma ligação peptídica entre o C-terminal e N-terminal.; (B) a ciclização entre os grupos funcionais, tais como uma ponte de dissulfureto entre resíduos de cisteína (1), ou uma ligação amida entre as cadeias laterais de lisina para aspártico / ácido glutâmico (2), ou a cadeia lateral de N ou C-terminal (3 -4); (C) ciclização adicionando aminoácidos extras ou derivados de aminoácidos ou moléculas pequenas, por exemplo, antes (R0) e depois (R7) a seqüência bioativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Síntese utiliza irradiação de microondas para aquecer reações, acelerando assim a química orgânica assistida por microondas transformações ^40,41. Microondas química baseia-se na capacidade de o reagente / solvente para absorver omicroondas energia e convertê-lo para aquecer ^42. Antes de a tecnologia se tornou generalizada, grandes inconvenientes tiveram que ser superados, incluindo a controlabilidade e reprodutibilidade dos protocolos de síntese e falta de sistemas disponíveis para temperatura e pressão controles adequados ^43,44. O primeiro relatório de síntese de peptídeos assistida por microondas foi feito usando um microondas cozinha para sintetizar vários péptidos curtos (7-10 aminoácidos) com melhoria significativa da eficiência de acoplamento e pureza ^45. Além disso, a energia de microondas foi demonstrado para diminuir a agregação de cadeia, reduzir as reacções secundárias, limitar a racemização, e melhorar as taxas de acoplamento, que são todos críticos para sequências longas e difíceis ^46-53.

Actualmente a utilização de irradiação de microondas para a síntese de péptidos ou compostos relacionados, um suporte sólido é extensiva, incluindo (a) síntese em água em vez de solvente orgânico ^54; (B) a síntese de peptídeos commodificações pós-traducionais comuns, tais como os glicopéptidos ^55-58 ou ^59-61 fosfopéptidos, cuja síntese é tipicamente difícil, devido à baixa eficiência de acoplamento dos derivados de aminoácidos estereoquimicamente impedidas; (C) a síntese de péptidos com modificação no esqueleto, tal como azapeptides, que pode ser formado pela substituição do C (α) de um resíduo de aminoácido com um átomo de azoto ^62, ou peptóides, cuja cadeia lateral está ligada ao azoto da amida em vez do átomo de Ca ^63,64; (D) a síntese de péptidos cíclicos ^65-71; e (E) a síntese de bibliotecas combinatórias ^51,72. Em numerosos casos, os autores relataram uma maior eficiência e reduziu o tempo de síntese que utilizam a irradiação de microondas, em comparação com o protocolo convencional.

Usando um desenho racional ^73-75, desenvolvemos peptídeos anti-parasitários que foram derivadas do receptor do andaime L de eishmania foR-quinase C activada (ausência). FALTA desempenha um papel importante na fase inicial de infecção por Leishmania ^76. Parasitas que expressam níveis mais baixos de FALTA deixar de parasitar mesmo ratos imunocomprometidos ^{77 como} FALTA está envolvida em processos de parasitas sinalização essenciais e síntese de proteínas ^78. Portanto, FALTA é uma chave de proteínas scaffold ^{79 e} um alvo de drogas valiosas. Focando em FALTA sequências que são conservadas em os parasitas, mas não no hospedeiro mamífero CREMALHEIRA homólogo, identificou-se um péptido de 8 amino ácidos (RNGQCQRK) que diminuiu Leishmania sp. Viabilidade em cultura.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de esqueleto cíclico péptidos derivados da sequência da proteína FALTA descrito acima. Os péptidos foram sintetizados num suporte sólido utilizando o aquecimento por microondas através da metodologia de SPPS com o protocolo Fmoc / tBu. Os péptidos foram conjugados com um péptido _47-57 (YGRKKRRQRRR) transportadora TAT através de uma ligação amida comoparte da SPPS. Transporte baseado no TAT de uma variedade de cargas em células tem sido usado por mais de 15 anos e entrega da carga em organelas subcelulares foi confirmada ^80. Quatro ligantes diferentes, succínico e anidrido glutárico, bem como adípico e ácido pimélico, foram usadas para efectuar a ciclização para gerar ligantes de ácidos carboxílicos de dois a cinco carbonos. A ciclização foi realizada por meio de energia de microondas, e a clivagem de cadeia lateral e passos de desprotecção final foi feita manualmente, sem energia de microondas. A utilização de um sintetizador de microondas automatizada melhora a pureza do produto, aumentou o rendimento do produto, e reduziu a duração da síntese. Este protocolo geral pode ser aplicada a outros estudos que utilizam péptidos compreender importante mecanismo molecular in vitro e in vivo e ainda desenvolver drogas potenciais para as doenças humanas.

Protocol

1. Equipamentos e Reagentes Preparação Preparar equipamentos Execute todas as etapas dentro de um exaustor utilizando equipamento de protecção individual adequado. Quimicamente sintetizar péptidos sobre suporte sólido utilizando um forno microondas sintetizador de péptidos com um módulo adicional da Discover equipado com uma sonda de temperatura de fibra óptica para controlar a entrega de microondas de energia em um vaso de reacção de Teflon (30 ml, com uma frita de vidro) ou de …

Representative Results

Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de uma pequena biblioteca focada de backbone peptídeos cíclicos que visam especificamente os PPIs vitais do parasita Leishmania e atuar como agentes antiparasitários (para revisão sobre peptídeos que têm como alvo os IPP como agentes antiparasitários 87). Através da síntese de novel backbone péptidos cíclicos, são conservadas em farmacóforos um andaime de tamanho extensível. A força da biblioteca focada aqui proposto é a capacidade de variar tam…

Discussion

A síntese de uma biblioteca focada backbone de péptidos cíclicos derivados da proteína falta de parasita Leishmania usando a um sintetizador de microondas é descrita completamente automatizado. Uma biblioteca orientada de péptidos cíclicos foi desenvolvido com farmacóforos conservada e vários ligantes. A adição de vários ligantes, tais como o anidrido glutárico, anidrido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, lisina, ornitina, e outros blocos de construção podem ser utilizados para aument…

Materials

REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML	CBL	BR-1330	loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma	328634	Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Alfa Aesar	43465	Caution Toxic
			Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM)	Sigma	D65100	Caution Harmful
Dibromomethane (DBM)	Sigma	D41868	Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma	T62200	Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA)	Sigma	91707	Caution Corrosive/Toxic
Diethylether	Sigma	31690	Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS)	Sigma	233781	Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade	Sigma	270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN)	Fisher Scientific	A998-4	Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA)	Sigma	3440	Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine	Sigma	W290807	Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine	Sigma	270970	Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH)	Sigma	459844	Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)	Sigma	157260	Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Sigma	12804	Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Caution Irritant
Ninhydrin	Sigma	454044	Caution Harmful
Phenol	Sigma	P3653	Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN)	Sigma	11813	Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	221473	Caution Toxic
N,N’-	Sigma	38370	Caution Flammable/ Toxic
Diisopropylcarbodiimide (DIC)
4-Dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma	522805	Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride	Sigma	G3806	Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride	Sigma	239690	Caution Irritant/Harmful
Adipic acid	Sigma	A26357	Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid	Sigma	P45001	Caution Toxic/Irritant
Chloranil	Sigma	23290	Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde	Sigma	402788	Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer	Labconco	freezone 4.5
Vacuum pump	Franklin Electric	model 1101101416 with 3/4 HP	Alcatel pump with Franklin Motor
Polypropylene cartridge 12 ml	Applied Separation	2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge	Applied Separation	8157
Polypropylene cartridge 3 ml	Applied Separation	2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge	Applied Separation	8054
Stop cocks PTFE	Applied Separation	2406
Tubes flat, 50 ml	VWR	21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams™ nutator mixer	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml	Fisher scientific	03-312-8
Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB-501, 500 ml
Heating block	Thermolyne	1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end	Fisher Scientific	14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette	Thermo	20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100	VWR	69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap	VWR	66030-600
Analytical HPLC column	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge	Waters	OBD C18 5 µm column	19 mm × 150 mm
Mass spectrometer	Applied Biosystems	Voyager DE-RP