This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Lig adskillelse af genomet under celledelingen kræver korrekte interaktioner mellem de replikerede DNA og spindel mikrotubuli. Mikrotubuli fysisk interagerer med kromosomer gennem et ensemble af proteiner, der samler på centromerer kendt som kinetochore 1. Korrekt fordeling af kromosomer kræver, at søster kinetochores er tovejsorienteret, hvor hver søster er forbundet med mikrotubuli oprindelse fra modstående spindel poler. Kinetochore mikrotubuli (kt-MT) vedhæftede filer, der ikke er i tovejsorienteret kropsbygning er hurtigt og effektivt destabiliseret at give mulighed for at etablere biorientation i en proces kendt som fejlretning. En fejlkorrektion assay, der tidligere blev etableret i pattedyrceller 5 kræver samling monopolære spindler ved hjælp af reversible inhibitorer med små molekyler mod EG5 (kinesin-5). Det stof behandling genererer et væld af fejlagtige syntelic vedhæftede filer, hvor both søster kinetochores tillægger den samme spindel pol. En efterfølgende udvaskning af lægemidlet muliggør visualisering af fejlkorrektion proces. Fejlkorrektion assay kan udføres i nærvær af inhibitorer med lille molekyle eller knockdowns at studere bidraget af kandidat-proteiner at rette fejlagtige kt-MT vedhæftede filer.
Evnen til at visualisere fejlkorrektion i levende celler er et kraftfuldt værktøj til yderligere at forstå den molekylære mekanisme er involveret i denne komplekse proces. Men det store antal kromosomer er til stede i de fleste cellelinjer udgør en udfordring i at observere individuelle kt-MT vedhæftede filer. Drosophila S2-celler ville være ideel til anvendelse fejlkorrektion assay, da de indeholder så få som 4 kromosomer 6, men med små molekyler inhibitorer af kinesin 5 såsom S-trityl-L-cystein (STLC) og monastrol 7-9 berører ikke spindel samling eller kinesin-5 motorisk funktion i Drosophila-celler. Vi har derfor slægterTed en Drosophila S2-cellelinie, der udtrykker human kinesin-5 under en inducerbar promotor, der er følsom over for kinesin-5-hæmmere. Denne protokol beskriver, hvordan man Knockdown det endogene Drosophila kinesin-5 homolog, Klp61F, og bruge denne cellelinie i det cellebaserede fejlkorrektion assay.
Visualisere fejlkorrektion er en værdifuld teknik til at undersøge de trin, der er involveret i denne vigtige og komplekse cellulære proces. For at gøre dette, er fejlagtige vedhæftede filer genereres ved hjælp af reversible inhibitorer, og fejlkorrektion er observeret ved udvaskning af lægemidlet. Dette assay blev oprindeligt udviklet under anvendelse af pattedyr vævskulturceller 5. Men tilstedeværelsen af store antal kinetochores i mange model pattedyrcelletyper en udfordring i at observere enkelte arrangementer fejlkorrektion. Drosophila S2 celler besidder så få som 4 par kinetochores, hvilket gør dem en mere foretrække cellelinie til at observere fejlkorrektion. En stor ulempe er, at mange inhibitorer er ineffektive i Drosophila S2-celler. Evnen til at generere et humaniseret Drosophila S2-cellelinien udtrykker human kinesin-5 giver et værdifuldt værktøj til at studere fejlkorrektion.
Selv Drosophila S2-celler kan være enbedre cellelinje at studere fejlkorrektion, de mange trin involveret i at opnå cellelinje og vælte væsentlige gener stiller nogle udfordringer til denne teknik. For eksempel kan transfektionseffektivitet være ganske lav. Hvis mindre end 20% af cellerne udtrykker EG5-mCherry bør transfektionen gentages så udvælgelsesprocessen vil tage længere tid. Ligeledes kan procentdelen af celler, der udtrykker begge fluorescerende proteiner falde over tid. Dette kan overvindes ved at opdele cellerne i nærvær af Blasticidin S HCI og hygromycin B til selektion for celler, der udtrykker EG5-mCherry og GFP-α-tubulin hhv. Det er også vigtigt at bemærke, at Drosophila S2-celler har orthologer til mange humane proteiner og; derfor er det vigtigt at optimere knockdown betingelser for de endogene proteiner. Optimale Knockdown betingelser kan variere i mængden af dsRNA og længden af behandlingen. I betragtning af fremkomsten og hurtig forbedring af CRISPR-Cas9 teknologiske stadees 15-17, generering af en Drosophila-cellelinie med Klp61F genet erstattet med human EG5 præsenterer en stærkt alternativ, som ville overvinde begrænsningerne af transfektion og knockdown tilgang. Vores arbejde viser, at flyve til menneske generstatning bør være en farbar vej i dette tilfælde selv de nødvendige reagenser til at gøre det i Drosophila S2-celler er under udvikling.
Denne procedure er ikke begrænset til EG5, men kan anvendes til at studere funktionen af andre proteiner af interesse. Hvis du bruger inhibitorer, der tidligere har været oprettet for at være ineffektiv i Drosophila S2-celler, kan denne protokol ændres til at studere den direkte virkning af inhibitorer i levende celler uden bekymringer om forbi mål effekter. Cellelinjen fremstilles ved hjælp af denne protokol kan også anvendes i high-throughput screening analyser for at identificere potentielle lægemidler rettet mod proteiner involveret i fejlkorrektion.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Patricia Wadsworth for gaven af kinesin-5 konstruktion. Dette arbejde blev støttet af en NIH tilskud (5 R01 GM107026) til TJM og af Research Grant No. 5-FY13-205 fra March of Dimes Foundation til TJM, samt støtte fra Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. til TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |