Меры предосторожности и эксплуатационные процедуры в (A) BSL-4 лаборатории: 2. Общие правила
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Работа в лаборатории сдерживания уровня биологической безопасности 4 (BSL-4) требует времени и большого внимания к деталям. Та же работа, которая проводится в лаборатории BSL-2 с не высоким следствие патогенов будет занять значительно больше времени в условиях BSL-4. Это увеличило потребность во времени из-за множества факторов, которые направлены на защиту исследователя от лабораторных инфекций, рабочей среды от возможного загрязнения и местного сообщества от возможного выброса высокого следствие патогенов. Внутри лаборатории, движение ограничено из-за воздушных шлангов, прикрепленных к обязательным костюмы безопасности всего тела. Кроме того, дезинфекция каждого элемента, который удаляется из шкафов класса II биобезопасности (БББ) требуется. Специалисты лаборатории должны быть обучены в практике лаборатории BSL-4 и должны показать высокий профессионализм в навыки, которые они выполняют. В центре внимания этой статьи состоит в том, чтобы наметить надлежащие процедуры и методы для обеспечения лабораторной бiosafety и точность эксперимента с использованием стандартного вирусного анализа бляшек в качестве примера процедуры. В частности, собственные методы для безопасной работы в среде BSL-4 при проведении эксперимента будет визуально подчеркнуты. Эти методы включают в себя: создание BSC класса II для проведения экспериментов, надлежащая очистка BSC класса II, когда закончили работу, по обращению с отходами и безопасной утилизации отходов, образующихся внутри BSL-4 лаборатории, а также удаление инактивированных образцов изнутри BSL- 4 лаборатории в лабораторию BSL-2.
Introduction
Как безопасность персонала лаборатории обработки высокого следственные патогенных микроорганизмов (нет инфекции профилактика, ни варианты лечения не существует) имеет первостепенное значение, У. С. Департамент здравоохранения и социальных служб США установило руководящие принципы для строительства объекта и передовых методов для безопасного проведения работы с патогенными микроорганизмами в биомедицинской и клинические лаборатории с точки зрения биологической безопасности 1. Посредством законодательства и регулирования, многие из практики и процедур стали обязательные требования, которые должны соблюдаться при работе с этими возбудителями. В США, патогенные микроорганизмы, которые легко передаются от человека к человеку, привести к высокому уровню летальности, и / или потенциально способных оказать значительное воздействие общественного здравоохранения и биотерроризма, классифицируются как Национальный институт здравоохранения / Национального института аллергии и инфекционных Болезнь (NIH / NIAID) Приоритет патогены и или центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) Bioterrorism категории а Агенты 2. Кроме того, чIGH-следствие патогенных микроорганизмов классифицируются как Tier 1 Выберите агентов , если эти патогены являются потенциальными агентами биотерроризма, имеют потенциал для массовых потерь или разрушительных последствий для экономики, жизненно важной инфраструктуры, или общественного доверия 3.
BSL-4 операции, в том числе доступ к институтам с BSL-4 лаборатории, более высоко, чем контролируется BSL-2/3 операций. Например, он значительно сложнее получить доступ к лаборатории BSL-4 по сравнению с лабораторией BSL-2 или BSL-3 из-за существенных требований костюма подготовки, обширные требования наставничества, а также дополнительные предпосылки медицинской биобезопасности. Кроме того, существуют , как правило , чем больше физических барьеров безопасности в BSL-4 в сравнении с объекта BSL-2 или BSL-3 объекта 4-6. Как указано в нашей первой статье о процедурах BSL-4 входа и выхода, сотрудники лаборатории проходят интенсивную подготовку и психологическое обследование , чтобы претендовать на вход в BSL-4 лаборатории 7. Within лаборатории BSL-4, риск инфекции и ошибок можно избежать или смягчить соответствии с установленными процедурами. Исследования должны действовать осторожно и сознательно, с минимальным многозадачности или отвлечений. Наклонившись в положительных скафандры трудно, и лицевые щитки могут ограничивать такие процедуры, как микроскопии. Громоздкие перчатки препятствовать выполнению тонких моторных задач, таких как обработка мелких предметов или маркировки труб. Чтобы свести к минимуму время, проведенное в BSL-4 лаборатории, специалисты лаборатории должны пересмотреть процедуры работы с целью определения шагов, которые могут быть сделаны заранее в лаборатории BSL-2, а затем транспортировать эти материалы в лаборатории BSL-4 для завершения задачи (ов). При удалении материалов для дальнейшей обработки в BSL-2 лаборатории, материалы фиксируются и удаляются из лаборатории BSL-4 в герметичном контейнере вторичного. Примеры образцов, которые, возможно, должны быть удалены, включают: фиксированные пластины или трубки зараженного материала, который будет проанализирован связанный с ферментом immunosorbeнт анализа (ИФА), иммунофлюоресценции (РИФ), или полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В дополнение к большим физическим ограничениям, налагаемым средств индивидуальной защиты, требуемой в BSL-4 лаборатории сравнению с теми в BSL-2 лаборатории, процедуры инактивации высокого следствие патогенов в клеточной культуре пластин и утилизации отходов являются более жесткими, чем те, которые необходимы для менее патогенных вирусов учился в лаборатории BSL-2. Как минимум, эти методы должны соответствовать CDC требованию. Например, загрязненными клеток культуральные планшеты и другие материалы могут быть инактивированы с химическими реагентами, такими как нейтральные-буферном растворе формалина. Обработанные клеточных культур пластин или труб должны быть помещены в мешочки уплотнения тепла, содержащие формалин и удалены из лаборатории через замочить бак, заполненный жидким дезинфицирующим средством. ведра мусора заполнены дезинфицирующими растворами и распылить дезинфицирующие средства используются для временного приема отходов, образующихся во время эксперимента и для DISInfecting перчатки, чистка кабинета биологической безопасности поверхностей и инструментов, соответственно. Четвертичные дезинфицирующий раствор аммония в концентрации перечисленных считается золотым стандартом для всех США BSL-4 лаборатории (Barr J, личное сообщение, 2015). Твердые отходы из ведра отходов автоклавируют, чтобы устранить возможность загрязнения.
В попытке наглядно продемонстрировать рабочий процесс и ограничения общих процедур BSL-4, мы использовали стандартный вирусный анализ зубного налета в качестве примера обычно используемой вирусной процедуры. В то время как вирусная процедура анализа описана в общем, мы подчеркиваем процедуры по биологической безопасности, используемые для обеспечения безопасности персонала лаборатории в данном протоколе. Пожалуйста , обратитесь к предыдущим классическим визуализаций анализа бляшек для дополнительного фона на бляшка анализа техники 8,9.
Процедуры , представленные здесь следовать спецификации BMBL намеченные CDC 1. Тем не менее, представленные протоколыспецифичные для IRF-Фредерик. Каждый BSL-4 объекта имеет различные стандартные операционные процедуры (СОП) и методы работы, которые влияют на выполнение экспериментов в лаборатории BSL-4. Альтернативные процедуры управления потоком отходов и выполнения анализов бляшки могут отличаться в зависимости от управления и функционирования этих лабораторий. Тем не менее, общее понимание установки костюма лаборатории и процедуры для выполнения работы с классом II шкафов внутри среды BSL-4 BSL-4 поможет ученым понять ограничения и последствия для безопасности при рассмотрении исследования высокого риска патогенов. Повышение информированности внешних сотрудников за трудностей, окружающих работу в лаборатории BSL-4 может привести к скорректированным ожиданий и большей легкостью в разработке медицинских контрмер против в научном сообществе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Работа в лаборатории BSL-4 требует значительного времени и дополнительного внимания к деталям. Любой тип работы в этой среде требует хорошо подготовленных, тщательное и добросовестные лиц. Стандартный вирусный анализ бляшек дает точную модель общей процедуры для работы с высоким следс?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
Referências
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
