Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

Summary

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model “organoids” that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

최근, 다양한 기술이이를 제조 또는 biofabricate 모색하여 기능 기관 및 조직의 대체 소스에 대한 필요성을 해결이 가능하게되었다. Bioprinting는이 기술의 가장 유망한 중 하나로 떠오르고있다. Bioprinting은 3 차원 패턴 가능한 기관 형상 또는 조직과 같은 구조를 구축하거나 사용할 수있는 생물학적 부품 로봇 첨가제 제조의 형태로 생각 될 수있다. 대부분의 경우 ¹ bioprinting 3 (3 차원을 채용 -D)함으로써 recapitulating 정확한 위치로 세포 및 생체 물질을 증착하기 위해 컴퓨터에 의해 지시되는 인쇄 장치 생리 아키텍처 해부학을 흉내 ^낸.이 이러한 장치 세포 집합체의 형태를 취할 수있는 "bioink"를 인쇄 하이드로 캡슐화 세포 점성 유체, 또는 셀 시드 미세 전달체뿐만 아니라 무 세포 PLA 기계적 구조 또는 행위를 제공하는 무 세포 중합체ceholders. ^3,4- bioprinting 처리 후는, 결과 구조는 기능적 조직 또는 기관 구조로 성숙하고 의도 된 최종 애플리케이션에 사용될 수있다. ^{-5,6- 현재까지} 완전한 완전히 기능 인간 크기 기관이 인쇄되지 않은, 하지만이 연구 개발 bioprinting의 주요 장기 목표가 남아있다. ⁽²⁾ 그러나, "organoid"티슈 구조물은 병리 모델링, 약물 개발 및 독성 검사를 포함하여 응용 프로그램으로 구현되는 소규모.

연구자 bioprinting 기술을 적용 발생한 주요 장애물 중 하나는 매우 적은 재료 bioprinting의 명시적인 목적으로 개발 된 것이있다. 효과적으로 bioprinting에서 성공하기 위해, 생체 재료 (4) 기본 요구 사항을 충족해야합니다. 바이오 물질이 증착을 허용하도록 1) 적절한 기계적 특성을 가질 필요가 (이것은 겔 또는 I와 같은 노즐을 통해 압출 될액적으로서 nkjet) 증착 후의 3 차원 구조의 구성 요소로 그 형상을 유지하기 위해, 2) 기능, 3)이 종래의 특성에 대한 사용자 제어 및 4) 셀 친절한 지원 환경에서 모든 기능 bioprinting 절차의 단계. ⁷ 역사적으로, 작업을 bioprinting는 종종 대신 bioprinting 및 후속 후 인쇄 응용 프로그램에 필요한 특성을 가지고 생체 재료의 설계, 자신의 호환성을 고려하지 않고 bioprinting 장치에서 기존의 전통적인 생체 재료를 사용하기 위해 노력하고 있습니다.

bioinks의 다양한 증착 및 제조 하드웨어와 더 나은 인터페이스에 최근에 개발되었다. 그들은 일반적으로 어느 전구체로서 충분한 기계적 특성, 또는 경우 노즐을 막히게 할 수있는 인쇄 또는 압출 공정에 망가가 중합 하이드로 유체 솔루션이 존재하기 때문에 표준 겔 시스템은 심각한 문제를 제기. 우리 팀뿐만 아니라 인접로rs는 하이드로 겔 기판에 세포 회전 타원체 인쇄, 마이크로 캐 필러 튜브에서 ^5,8 세포와 하이드로 겔 필라멘트 압출, 동적 가교 특성을 가진 ^9-11 압출 히알루 론산 (HA) – 금 나노 입자 하이드로 겔을 포함하여 이러한 bioprinting 문제를 해결하기 위해 다양한 하이드로 겔 제형을 살펴 보았다 광중합을 사용하여 하이드로 겔 강도의 ¹² 시간 제어, ¹⁷ HA 및 젤라틴, ¹³ 피브리노겐 – 트롬빈 계 가교제, ^{14, 15의} 이온 교환 알긴산 콜라겐 겔 ⁽¹⁶⁾ 메타 크릴 레이트 최근 급격한 중합 자외선 (UV) -initiated 가교

이러한 예는 효과적으로 bioprinted에 의해 수 생성 물질의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 하드웨어의 통합에 추가하여, 성공적 가능한 기능적 3-D 조직 구조를 생성하기 위해, 생체 물질은 세포 유지를 지원하는 생화학 적 및 기계적 신호를 포함해야생존과 기능. 이러한 추가 요인, 생화학 적 및 기계적 프로필, bioprinted 조직 구조의 성공적인 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

두 세포 및 원시 세포 외 기질 (ECM)는 이러한 성장 인자 및 다른 세포에 다른 사이토킨 신호 분자로서 폭넓게 제시 할 책임이있다. 이들 신호의 결합 조직의 조직에서 다르지만, 세포 및 조직의 행동을 조절하는 매우 강력한 영향력 수있다. ⁽¹⁸⁾ 탐색 된 다른 기관으로부터 조직 특이 ECM 부품을 채용하고, 하이드로 겔 또는 하이드로 겔의 일부로서 구현 성공. ^19-21, 주어진 조직 decellularizing을 분쇄하고, 용해 구성되는이 방법, 임의의 조직으로부터 조직 – 특이 적 생화학 적 신호를 생성하기 위해 3-D 하이드로 겔 구조에 혼입 될 수있는 이용 될 수있다. ⁽²²⁾

또한,그것이 널리 체내 조직을 강성의 넓은 범위를 차지하는 것이 설명되어있다. 이와 같이 ²³ 튜닝 능력 등 탄성률 E '또는 전단 탄성률 G'와 같은 생체 재료의 기계적 특성, 조직 공학에서 유용한 도구 . 전술 한 바와 같이, bioink 기계적 특성 제어 대상 기관 유형과 일치하는 다음 상기 탄성률 레벨이 달성 될 수있는 나중 지점에서 이차 가교에 의해 조작 할 수있는 연질 겔을 사용하여 압출 기반 biofabrication 허용한다. 예를 들어, 생체 재료는에서 작동하는이 organoids의 능력 증가, 이론 ^{(24, 25)을,} 네이티브 간처럼 ²³ ~ 10 kPa로의 강성을 일치 또는 기본 심장 조직처럼 10 ~ 15 kPa로의 강성에 맞게 사용자 정의 할 수 그 나라 티슈 대응 유사한 방식. 세포 표현형에 환경 강성의 영향은 특급있다특히 줄기 세포에 대하여, 최근 lored. 잉글 러 외는. 조직 탄성 기판의 그것과 일치하는 계통으로 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 구동에서 도움이 기판 탄성을 보였다. ⁽²⁵⁾ 이러한 개념은 상기 근육으로 분화, 심장 기능, 간 표현형, 조혈 줄기 세포의 증식에 대한 탐구 한 및 줄기 세포 치료 가능성의 유지. ^{24,26-29 조정할} 수있는 서로 다른 탄성률을 하이드로 겔은 조직 구조를 biofabricate 데 사용되는 생체 재료의 중요한 특징이다. ⁽³⁰⁾

여기에서는 압출 bioprinted 수있는 하이드로 겔 시스템을 공식화하기 위해 실험실에서 사용 다기능 방식을 나타내고, 특정의 조직 유형의 생화학 적 프로파일을 포함하고 2) 그 조직 유형의 탄성률을 모방) (1)에 정의 된 프로토콜을 설명 . 이러한 요구 사항을 해결함으로써, 우리는 페이지에 목표생체의 물리 화학적 및 생물학적 특성 요점을 되풀이 할 수있는 물질을 rovide ^{조직.도 31은} 여기에 기술 된 모듈러 하이드로 복합 시스템은 압출의 bioinks을 수득 다중 가교 방식을 활용하고 안정화시키는 보조 가교 결합을 허용하고의 강성을 증가 최종 제품은 조직 유형의 범위와 일치한다. 생화학 커스터마이즈 조직 특이 ECM 성분을 사용하여 만족된다. 데모, 우리는 기능 간 organoid 구조를 bioprint이 하이드로 겔 시스템의 간 고유의 다양한 사용합니다. 기술 된 프로토콜은 사용자 3 차원 bioprinting 장치를 사용한다. 일반적으로,이 프로토콜은 대부분 압출 기반 프린터에 적용 할 수 있고, 특정 인쇄 파라미터는 장치의 각 유형에 대해 극적으로 변화하고, 사용자에 의해 검사를 필요로한다.

Protocol

1. 하이드로 겔 Bioink 제형 및 준비 조직 특이 적 생화학 적 정보를 제공하기 이전에 상술 간 조직 특이 ECM 솔루션 다이제스트 준비하기 위해. 20 주 : 일반적으로, ECM 다이제스트 채용 최종 히드로 겔 bioink 용적의 40 %를 포함 할 것이다. ECM 다이제스트 솔루션의 수백 밀리리터가 준비 분주하고, 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다. 광개시제, 2- 히드 록?…

Representative Results

전술 한 과정이 올바르게 준수 할 때 하이드로 겔은 표적 조직 유형 특정 생화학 적 프로파일을 포함한다 (20) bioprinting 최종 탄성률 (34)을 통해 고도의 제어를 허용 및 조직 구조물은 가능한 기능 셀을 지원한다. 히드로 겔 지정 가장 모방 네이티브간에, 하이드로 겔 bioink이 간 ECM 솔루션과 성…

Discussion

인간 또는 시험 관내 스크리닝 응용 프로그램에 대한 최종 사용, 3 차원 조직 구조를 biofabricate 할 때 고려해야 할 중요한 몇 가지 구성 요소가 있습니다. biofabrication 장치 자체는 최종 구조에 도달하기위한 일반적인 방법을 결정하는 동안 적절한 세포 성분을 이용하는 것은 최종 잠재적 기능을 결정한다. 이 이중 역할을 역할로 세 번째 구성 요소, 바이오 물질은 똑같이 중요하다. 특히, 생체…

Materials

Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform