חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em> In vivo</em> ו<em> Ex Vivo</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
מחקרים רבים מבקשים לזהות ולמפות את אזורי המוח מעורבי תקנות פיסיולוגיות ספציפיות. The-פוס ג פרוטו-אונקוגן, גן ראשונים מיידי, מתבטא נוירונים בתגובה לגירויים שונים. מוצר החלבון ניתן לאתר בקלות עם טכניקות immunohistochemical המובילות לשימוש של זיהוי c-FOS למפה קבוצות של נוירונים המציגים שינויים בפעילותם. במאמר זה התמקדנו בזיהוי אוכלוסיות גזע המוח עצבי מעורבת הסתגלות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia. שתי גישות תוארו לזהות אוכלוסיות נוירונים מעורבים vivo בחיות לשעבר vivo בהכנות גזע המוח deafferented. בשנת vivo, בעלי חיים שנחשפו תערובות גז hypercapnic או חוסר חמצן. גופיים, ההכנות deafferented היו superfused עם חוסר חמצן או מלאכותי הנוזל השדרתי hypercapnic. בשני המקרים, בין אם מלא בחי vivo או דוארx הכנות vivo נשמרו בתנאי normoxic ו normocapnic. ההשוואה של שתי גישות אלה מאפשר קביעת מקורם של קרי ההפעלה העצבית, היקפי ו / או מרכזי. בשנת vivo לשעבר vivo, brainstems נאספו, קבוע, ופרוסים למקטעים. לאחר סעיפים הוכנו, זיהוי immunohistochemical של חלבון C-FOS נעשה על מנת לזהות את קבוצות גזע המוח של תאים מופעלים על ידי גירויים היפוקסי או hypercapnic. תאים תווית נספרו במבנים הנשימה בגזע המוח. לשם השוואה למצב מלא, היפוקסיה או hypercapnia הגדיל את מספר תאי שכותרתו ג-FOS באתרי גזע מוח כמה הספציפיים מונחים ובכך מכוננים של המסלולים העצביים המעורבים בעיבוד של כונן הנשימה המרכזי.
Introduction
הגן פוס c- זוהה לראשונה בתחילת 1980 1,2 ו מוצריה התאפיין בשנת 1984 כחלבון גרעיני בעלי תכונות-מפעיל גנים 3,4. והיא הועלתה מנגנוני לטווח ארוך הקשורים גירוי נוירון. ואכן, שינויים בפעילות עצבית להוביל מפלי שניית שליח איתות משרי הביטוי של C-FOS הגן מוקדם המיידי, אשר גורם ייצור של גורם שעתוק ג-FOS. האחרון יוזם את הביטוי של גנים מאוחר ובכך משתתף בתגובות הסתגלות של מערכת העצבים לסוגים רבים ושונים של 4 גירויים. לכן, מאז סוף 1980 5,6, זיהוי החלבון C-FOS נעשה בהם שימוש תכוף כדי לחקור את ההשפעות של הגורמים החיצוניים על שעתוק הגנים בכלל 4 ועל הפעילות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עבור מיפוי מסלולים עצביים מעורב פיזיולוגי שונהתנאי al.
C-FOS בסל הביטוי נחקר במינים שונים, כוללים עכברים, חולדות, חתולים, קופים, ואנושי 4. ובכך, קינטיקה הביטוי שלה ידוע טוב יחסית. הפעלת השעתוק היא מהירה (5 עד 20 דקות) 7,8, והצטברות mRNA מגיעה לשיא בין 30 ל -45 דקות לאחר תחילת גירוי 9 וירידה עם זמן מחצית חיים קצרים של 12 דקות. סינתזת חלבון C-FOS כדלקמן הצטברות mRNA ויכולה להיות מזוהית על ידי אימונוהיסטוכימיה ב 20 כדי 90 דקות פוסט גירוי 6.
ניתוח של ביטוי c-Fos משמש קלסי במחקרי in vivo לזהות את רשת הנשימה המרכזית המעורבת בתגובות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia 10-14. לאחרונה, הכלי הזה שמש גם בהכנות גזע מוח vivo לשעבר לחקור עיבודי רשת נשימה מרכזיים היפוקסיה או hypercapnia 15-18. ואכן, הכנות אלה ליצור פעילות קצבית מתבוללים קלסיים לכונן הנשימה המרכזית 19. לכן, זה סוג של הכנה יש את היתרון של להיות deafferented לחלוטין, ולכן, תוצאות לגבי הביטוי פוס-ג רק לשקף את התוצאות של גירוי מרכזי ללא כל התערבות של מבנים היקפיים.
גילוי ג-FOS יכול להתבצע על ידי גישות immunohistochemical או immunohistofluorescence. עקיפת immunodetection מחייב שימוש נוגדן ראשוני נגד ג-FOS וכן נוגדנים משני המכוונים נגד המין שבו הנוגדן הראשוני הופק. לקבלת השיטה immunohistochemical, נוגדנים משני הוא מצומדות עם אנזים (peroxidase, למשל) שפועל על מצע (H 2 O 2 עבור peroxidase). המוצר של התגובה האנזימטית הוא פותח על ידי אַב צֶבַע (3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloridה), אשר מכתים אותו ניתן לראות תחת מיקרוסקופ אור. התגובה יכולה להיות מחוזקת באמצעות אמוניום סולפט ניקל. שיטות אלה מאפשרים זיהוי של נוירונים פעילים במהלך אתגרים פיסיולוגיים שונים ולכן זיהוי ו / או המיפוי של מסלולים היקפיים ומרכזי מעורב התגובות הפיזיולוגיות הרצופות.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-Fos הוא גן מוקדם מיידי, ואת זיהוי המוצרים שלה, חלבון C-FOS, משמש קלסי לזהות אוכלוסיות נוירונים המעורבים בתגובות נשימה ספציפיות in vivo 11,13,25,28 לשעבר vivo 16-18, 27,32,33.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
Referências
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat’s neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neurociência. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neurociência. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neurociência. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neurociência. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
