הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים
Summary
לצבוע ratiometric רגיש pH משמש בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal וניתוח תמונה דיגיטלית לפקח pH תאיים biofilms שיניים בזמן אמת.
Abstract
ה- pH ב biofilms חיידקים על השיניים היא בעלת חשיבות מרכזית עבור עששת, מחלה עם שכיחות ברחבי העולם גבוהה. Nutrients מטבוליטים אינם מתחלקים באופן שווה ב biofilms שיניים. גומלין מורכב של וספיחה כדי ותגובה עם חומר אורגני ביופילם מפחית השבילים דיפוזיה של מומסים ויוצר הדרגתיים תלולה של מולקולות, כוללים חומצות אורגניות, מעבר ביופילם. שיטות מיקרוסקופיות פלורסנט כמותי, כגון הדמיה זמן החיים הקרינה או pH ratiometry, יכול להיות מועסק על מנת להמחיש pH במיקרו-סביבות שונות של biofilms שיניים. pH ratiometry מנצל משמרת תלויי pH של פליטת ניאון של צבעים pH רגיש. חישוב יחס הפליטה בשני אורכי גל שונים מאפשר קביעת pH מקומית תמונות מיקרוסקופיות, ללא קשר הריכוז של הצבע. בניגוד microelectrodes הטכניקה מאפשרת ניטור הוא הדרגתי pH אנכי ואופקית בזמן אמת עםמתוך מכאני להפריע ביופילם. עם זאת, יש להקפיד להבדיל במדויק בין תאי חוּץ ו התאיים של ביופילם. הנה, לצבוע ratiometric, seminaphthorhodafluor-4F 5 (ו -6) חומצה קרבוקסילית (C-SNARF-4) הוא מועסק כדי לפקח pH תאיים in vivo גדל biofilms שיניים של הרכב מינים שאינם מוכרים. בחשיפה לגלוקוז לצבוע תלוי-המרוכז בתוך כל תאי חיידקי biofilms; הוא ובכך לשמש הוא כתם אוניברסלית חיידקים כסמן של pH התאי. לאחר רכישת תמונה מיקרוסקופית confocal, ביומסה החיידקים תוסר כל התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית, המאפשרת לחשב pH התאי באופן בלעדי. ratiometry pH עם צבע ratiometric הוא מותאם היטב כדי ללמוד pH התאי biofilms הדקה של עד 75 מיקרומטר עובי, אבל מוגבל בטווח pH בין 4.5 ו -7.0.
Introduction
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניטור pH תאיים biofilms שיניים בטווח שבין 4.5 ו -7, באמצעות צבע ratiometric seminaphthorhodafluor-4F 5 (ו -6) חומצה קרבוקסילית (C-SNARF-4) בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal ו ניתוח תמונה דיגיטלי. צבע פלואורסצנטי המועסק הוא pH רגיש ומציג שינוי פליטתו פלורסנט בהתאם למצב של protonation. פליטת הניאון של פסגות מולקולת protonated ב 580 ננומטר, ואת פליטת מולקולת deprotonated ב 640 1 ננומטר. היחס בין עוצמות פליטת הניאון בשני חלונות זיהוי הכולל שתי פסגות הפליטה (576 – 608 ננומטר 629 – 661 ננומטר) ובכך משקפים pH בשלב הנוזלי, ללא קשר ריכוז לצבוע. עם א א PK של ~ 6.4 לצבוע מתאים לדמיין pH בסביבות חומציות מתונה.
PH ב biofilms חיידקי היא בעלת חשיבות מרכזית לכל התהליכים המטבוליים.במקרה של biofilms שיניים, pH במטריצה התאית הוא הגורם ארסי מפתח לפיתוח עששת. תקופות ממושכות עם pH הנמוך ביתרון ממשק ביופילם-שן להאט איבוד מינרלי האמייל הבסיסי 2. בשל הארכיטקטורה תלת-ממדי המורכבת של biofilms, מטבוליטים, כוללים חומצות אורגניות, אינם מפוזרים באופן אחיד על פני ביופילם. מאוד ופחות microenvironments acidogenic ניתן למצוא בסמיכות מרחבית קרובות 3.
במשך עשרות שנים, הדרגתיים pH אנכי biofilms נרשמו בעזרת microelectrodes 4-6. בעוד שהם מציעים רזולוצית מרחבית טובה בשל גודל טיפ הקטן שלהם, הם לא מתאימים היטב כדי לפקח הדרגתיים אופקיים. יתר על כן, החדרת אלקטרודה מפריעה ביופילם מכנית. טכניקות מיקרוסקופיות פלורסנט כמוני מציעות את היתרון של ביטוי חזותי שינויי pH באזורים שונים של ביופילם ללא מכנים להפריעNCE. שדות מיקרוסקופים מבט שונים ניתן לבחור באופן חופשי צלמו שוב ושוב לאורך תקופות ממושכות 1,7-9. עם זאת, כאשר מפרשים תמונות ביופילם מיקרוסקופיות, חשוב להבחין בין הקרינה הנובעת ביומסה מיקרוביאליים הקרינה הנובעת מן המרחב התאי. בתנאים חומציים, pH בתוך תאי חיידקיים שונה pH בתוך תאי מטריקס, כמו החיידקים פעילים להעביר פרוטונים על פני קרום התא שלהם על חשבון אדנוזין אדנוזין 10. בהקשר של עששת, pH חיידקי תאיים אין השפעה ישירה על האמייל הבסיסי ואילו pH תאיים הנמוך מוביל איבוד מינרלים. מיצוע pH ב תמונות מיקרוסקופיות שמכילות הוא חיידקים ללא באזורים וחיידקים מוביל לתוצאות שגויות. השימוש כתם אחרים יחד עם צבע pH הרגיש על מנת להמחיש את ביומסה החיידקים ולבדל בין אזורי חוּץ ו תאיים מביא abאת הסיכון לזיהום הניאון של מרחב התאים ומדידות שווא 11.
כתב היד הנוכחי ולכן מתאר את השימוש של צבע ratiometric ב תפקיד כפול; הן כסמן pH ו ככתם חיידקים אוניוורסלי. כמו לצבוע תלוי-מרוכזים תאים חיידקיים, השילוב של הדמיה מיקרוסקופית confocal ונוהל ניתוח תמונה דיגיטלית מדויקת מאפשר קביעת pH תאיים בטווח שבין 4.5 ו -7.0 ב biofilms שיניים דק.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניטור מיקרוסקופי של pH ביופילם מספק מספר יתרונות, לעומת מדידות אלקטרודה או microelectrode 4-6. טכניקות מיקרוסקופיות להתיר לקבוע pH עם רזולוציה מרחבית גבוהה ולאפשר לכידה הן הדרגתיים pH אופקי ואנכי ב biofilms מבלי להפריע ביופילם מכאנית. ניסיונות קודמים של ניטור pH המיקרוסקופי, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות חבייר א גרסיה Lene גרונקיאר לקבלת סיוע טכני Merete ק Raarup לדיונים פוריים. עבודה זו מומנה על ידי ארהוס אוניברסיטת Research Foundation ואת סיימון ספייס קרן.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
