Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH i Dental Biofilm
Summary
Et pH-følsomt fargestoff ratiometrisk brukes i kombinasjon med konfokal laser-skanning mikroskopi og digital bildeanalyse for å overvåke ekstracellulære pH i tann biofilmer i sanntid.
Abstract
PH i bakterie biofilmer på tennene er av sentral betydning for tannråte, en sykdom med høy globale utbredelsen. Næringsstoffer og metabolitter blir ikke fordelt jevnt i dental biofilm. Et komplekst samspill av sorpsjon til og omsetning med organisk materiale i biofilm reduserer diffusjon banene for oppløste stoffer og skaper bratte stigninger av reaktive molekyler, inkludert organiske syrer, på tvers av biofilm. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske metoder, for eksempel fluorescens levetid avbildning eller pH ratiometry, kan brukes til å visualisere pH i ulike microenvironments tann biofilm. pH ratiometry utnytter en pH-avhengig skift i fluorescensemisjonen fra pH-følsomme fargestoffer. Beregning av emisjonsforholdet ved to forskjellige bølgelengder gjør det mulig å bestemme lokal pH i mikroskopiske bilder, uavhengig av konsentrasjonen av fargestoffet. I motsetning til mikroelektroder teknikken tillater overvåking både vertikale og horisontale pH-gradienter i sanntid medut mekanisk forstyrre biofilm. Imidlertid må man sørge for å skille nøyaktig mellom ekstra- og intracellulære kamre i biofilmen. Her er den ratiometrisk fargestoff, seminaphthorhodafluor-4F 5- (og 6-) karboksylsyre (C-snarf-4) anvendes for å overvåke ekstracellulære pH i in vivo-dyrket tann biofilm med ukjent artssammensetning. Ved eksponering til glukose fargestoffet er opp-konsentrert på innsiden av alle bakteriecellene i biofilmer; Det benyttes således både som en universell bakterie flekk og som en markør av ekstracellulært pH. Etter confocal mikroskopisk bilde oppkjøpet, er bakteriell biomasse fjernes fra alle bildene ved hjelp av digital bildeanalyse programvare, som tillater å utelukkende beregne ekstracellulære pH. pH ratiometry med den ratiometrisk fargestoffet er godt egnet for å studere ekstracellulære pH i tynne biofilm på opp til 75 um tykkelse, men er begrenset til det pH-område mellom 4,5 og 7,0.
Introduction
Den metode som er beskrevet her gjør det mulig å overvåke ekstracellulære pH i tann biofilmer i området mellom 4.5 og 7, ved hjelp av ratiometrisk fargestoff seminaphthorhodafluor-4F 5- (og 6-) karboksylsyre (C-snarf-4) i kombinasjon med konfokal laser-skanning mikroskopi og digital bildeanalyse. Den næringsdrivende fluorescerende fargestoff er pH-følsomt og viser et skifte i sin fluorescensemisjon avhengig av tilstanden av protonering. Fluorescensemisjonen fra de protonerte molekyl topper ved 580 nm, og emisjonen av den deprotonerte molekylet ved 640 nm 1. Forholdet mellom fluorescens-emisjonsintensitet i to deteksjons vinduer omfattende de to utslipps toppene (576-608 nm og 629-661 nm) reflekterer således pH-verdien i den flytende fase, uavhengig av fargestoff konsentrasjon. Med en pKa på ~ 6,4 fargestoffet er egnet til å visualisere pH i moderat sure miljøer.
PH i bakterielle biofilmer er av sentral betydning for alle metabolske prosesser.I tilfelle av tann biofilmer, pH i den ekstracellulære matriks er nøkkelen virulens faktor for utviklingen av karies. Lengre perioder med lav pH i biofilm-tann grensesnitt føre til treg demineralisering av den underliggende emalje to. På grunn av den komplekse tredimensjonale arkitektur av biofilm, metabolitter, innbefattende organiske syrer, ikke er jevnt fordelt på tvers av biofilm. Høyt og mindre acidogenic microenvironments kan finnes i umiddelbar romlig nærhet tre.
I flere tiår ble vertikale pH-gradienter i biofilmer spilt inn med hjelp av mikroelektroder 4-6. Mens de tilbyr en god romlig oppløsning på grunn av sin lille spissen størrelse, de er ikke godt egnet til å overvåke horisontale gradienter. Videre, innføring av elektroden forstyrrer biofilmen mekanisk. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske teknikker tilbyr fordelen av å visualisere pH-endringer i ulike områder av en biofilm uten mekanisk forstyrreNCE. Ulike mikroskopiske synsfelt kan velges fritt og avbildes gjentatte ganger over lengre perioder 1,7-9. Imidlertid, når man tolker mikroskopiske biofilm-bilder, er det viktig å skille mellom fluorescens som stammer fra mikrobiell biomasse og fluorescens som stammer fra det ekstracellulære rom. I sure betingelser, pH innenfor bakteriecellene er forskjellig fra pH-verdien i den ekstracellulære matriks, som bakterier aktivt transporterer protoner gjennom cellemembranen på bekostning av adenosintrifosfat 10. I sammenheng med karies, betyr intracellulær bakterie pH ikke har en direkte innvirkning på de underliggende emalje mens lav ekstracellulære pH fører til demineralisering. Gjennomsnitt pH i mikroskopiske bilder som inneholder både bakteriefrie områder og bakterier fører til feilaktige resultater. Bruken av andre flekker sammen med den pH-følsomt fargestoff for å visualisere bakteriell biomasse og skille mellom ekstra- og intracellulære områder bringer abut risikoen for fluorescerende forurensning av det ekstracellulære rom og falske målinger 11.
Den foreliggende manuskriptet beskriver således bruken av den ratiometrisk fargestoff i en dobbeltfunksjon; både som en pH-markør og som en universell bakterie flekk. Som fargestoff er opp-konsentrert i bakterieceller, er kombinasjonen av konfokal mikroskopisk avbildning og en nøyaktig digital bildeanalyse fremgangsmåte tillater bestemmelse av ekstracellulære pH i området mellom 4,5 og 7,0 i tynne tann biofilmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopisk overvåking av biofilm pH gir flere fordeler, sammenlignet med elektroden eller microelectrode målinger 4-6. Mikroskopiske teknikker som tillater å bestemme pH-verdien med en høy romlig oppløsning og tillater å fange både horisontale og vertikale pH-gradienter i biofilmer uten å forstyrre biofilmen mekanisk. Tidligere forsøk av mikroskopiske pH-måling er imidlertid ikke klart å skille mellom ekstracellulær og intracellulær pH i biofilmer 1,7,9. På grunn av bakteriell homeo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Javier E. Garcia og Lene Grønkjær for teknisk assistanse og Merete K. Raarup for fruktbare diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av Aarhus University Research Foundation og Simon Spies Foundation.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
