Propportionell Imaging av extracellulära pH i Tand Biofilmer
Summary
Ett pH-känsligt ratiometrisk färgämne används i kombination med konfokala laserskanning mikroskopi och digital bildanalys för att övervaka extracellulära pH i tand biofilmer i realtid.
Abstract
PH i bakterie biofilmer på tänderna är av central betydelse för karies, en sjukdom med hög världsomspännande prevalens. Näringsämnen och metaboliter inte fördelas jämnt i tand biofilmer. Komplex samspel av sorption till och reaktion med organiskt material i biofilmen minskar diffusionsvägarna av lösta ämnen och skapar branta gradienter av reaktiva molekyler, innefattande organiska syror, över biofilmen. Kvantitativa fluorescerande mikroskopiska metoder, såsom fluorescens livstid avbildning eller pH ratiometry, kan användas för att visualisera pH i olika mikromiljöer av dentala biofilmer. pH ratiometry utnyttjar en pH-beroende förändring i den fluorescerande emissionen av pH-känsliga färgämnen. Beräkning av emissionsförhållandet vid två olika våglängder medger bestämning lokala pH i mikroskopiska bilder, oberoende av koncentrationen av färgämnet. I motsats till mikroelektroder tekniken tillåter övervakning både vertikala och horisontella pH-gradienter i realtid medut mekaniskt störa biofilmen. Emellertid måste försiktighet iakttas för att noggrant skilja mellan extra- och intracellulära fack i biofilmen. Här, den kvotmetriska färgämnet seminaphthorhodafluor-4F 5- (och-6) karboxylsyra (C-Snarf-4) används för att övervaka extracellulära pH i in vivo odlas tand biofilmer av okänd artsammansättning. Vid exponering för glukos färgämnet är upp-koncentreras i alla bakterieceller i biofilmer; den används sålunda både som en universell bakterie fläcken och som en markör för extracellulärt pH. Efter konfokala mikroskopisk bild förvärv, är den bakteriella biomassan bort från alla bilder med digital bildanalys programvara som tillåter att enbart beräkna extracellulära pH. pH ratiometry med ratiometrisk färgämnet är väl lämpad för att studera extracellulärt pH i tunna biofilmer på upp till 75 um tjocklek, men är begränsad till pH-intervallet mellan 4,5 och 7,0.
Introduction
Den här beskrivna metoden gör det möjligt att övervaka extracellulära pH i dental biofilmer i intervallet mellan 4,5 och 7, med användning av den kvotmetriska färgämnet seminaphthorhodafluor-4F 5- (och-6) karboxylsyra (C-snarf-4) i kombination med konfokal laserscanningsmikroskopi och digital bildanalys. Sysselsatta fluorescerande färgämne är pH-känslig och visar en förändring i sin fluorescensemission beroende på tillståndet hos protone. Den fluorescerande emission av protone molekyl toppar vid 580 nm, och emissionen av deprotonerade molekylen vid 640 nm en. Förhållandet mellan de fluorescerande emissionsintensitet i två detekteringsfönster som innefattar de två emissionstopparna (576-608 nm och 629-661 nm) återspeglar således pH i den flytande fasen, oberoende av färgkoncentrationen. Med ett pKa av ~ 6,4 färgämnet är lämpligt att visualisera pH i måttligt sura miljöer.
PH i bakteriella biofilmer är av central betydelse för alla metaboliska processer.I fallet med tand biofilmer, är pH i den extracellulära matrisen nyckeln virulens faktor för utvecklingen av dental karies. Längre perioder med lågt pH vid biofilmen tand gränssnitt leder till långsam demineralisering av den underliggande emalj 2. Grund av den komplexa tredimensionella arkitekturen i biofilmer, metaboliter, innefattande organiska syror, inte är enhetligt fördelade över biofilmen. Mycket och mindre syrabildande mikromiljöer kan hittas i nära fysisk närhet 3.
I årtionden har vertikala pH-gradienter i biofilmer som spelats in med hjälp av mikroelektroder 4-6. Medan de erbjuder en bra rumslig upplösning på grund av sin lilla spetsstorlek, är de inte väl lämpade för att övervaka horisontella gradienter. Dessutom införing av elektroden stör biofilmen mekaniskt. Kvantitativa fluorescerande mikroskopiska tekniker erbjuder fördelen med att visualisera pH-förändringar i olika områden av en biofilm utan mekanisk interfererance. Olika mikroskopiska synfält kan väljas fritt och avbildas flera gånger under längre perioder 1,7-9. Men när man tolkar mikroskopiska biofilm bilder, är det viktigt att skilja mellan fluorescens som härrör från den mikrobiella biomassan och fluorescens som härrör från det extracellulära utrymmet. Under sura betingelser, är pH inuti bakterieceller skiljer sig från pH i den extracellulära matrisen, som bakterierna aktivt transportera protoner över deras cellmembran på bekostnad av adenosintrifosfat 10. Inom ramen för karies, inte intracellulär bakterie pH inte har en direkt inverkan på de underliggande emalj, medan låg extracellulära pH leder till demineralisering. Genomsnitt pH i mikroskopiska bilder som innehåller både bakteriefria områden och bakterier leder till felaktiga resultat. Användning av andra fläckar tillsammans med pH-känsligt färgämne för att visualisera den bakteriella biomassan och skilja mellan extra- och intracellulära områden ger abut risken för fluorescerande kontaminering av det extracellulära utrymmet och falska mätningar 11.
Föreliggande manuskript beskriver därför användning av den kvotmetriska färgämnet i en dubbel funktion; både som en pH-markör och som en universell bakterie fläck. Som färgämnet är upp-koncentreras i bakterieceller, en kombination av konfokala mikroskopisk avbildning och en korrekt digital förfarande bildanalys medger bestämning extracellulärt pH i området mellan 4,5 och 7,0 i tunna tand biofilmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopisk analys av biofilm pH ger flera fördelar, jämfört med elektrod eller mikroelektrodmätningar 4-6. Mikroskopiska tekniker tillåter att bestämma pH med en hög rumslig upplösning och tillåta fånga både horisontella och vertikala pH-gradienter i biofilmer utan att störa biofilmen mekaniskt. Tidigare försök av mikroskopisk pH-övervakning, dock misslyckats med att skilja mellan extracellulära och intracellulära pH i biofilmer 1,7,9. På grund av bakteriell homeostas skiljer in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Javier E. Garcia och Lene Grønkjær för tekniskt stöd och Merete K. Raarup för givande diskussioner. Detta arbete har finansierats av Aarhus University Research Foundation och Simon Spies Foundation.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
