Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme
Summary
Bir pH-duyarlı rasyometrik boya gerçek zamanlı olarak diş biyofilmlere ekstrasellüler pH izleme konfokal lazer tarama mikroskobu ve dijital görüntü analizi ile kombinasyon halinde kullanılır.
Abstract
dişler üzerinde bakteri Biyofilmlererde pH diş çürüğü, yüksek dünya çapında yaygınlık bir hastalık için merkezi öneme sahiptir. Besinler ve metabolitleri diş Biyofilmlererde eşit olarak dağıtılır değildir. biyofilm organik madde ile karşı emilim ve reaksiyon karmaşık bir etkileşim çözünenlerin difüzyon yolları azaltır ve biyofilm karşısında, organik asitler içeren reaktif moleküllerin dik rampaları oluşturur. Bu floresans ömrü görüntüleme ya da pH ratiometry olarak kantitatif flüoresan mikroskopi yöntemler, diş biyofilm farklı mikroçevrelerde pH görselleştirmek için kullanılabilmektedir. pH ratiometry pH'a duyarlı boyalar, floresan emisyonunda bir pH değerine bağımlı bir değişim patlatır. iki farklı dalga boylarında emisyon oranı hesaplaması olmaksızın boya konsantrasyonu, mikroskobik görüntüleri lokal pH belirlenmesi sağlar. ile gerçek zamanlı olarak hem dikey hem de yatay pH geçişlerini takip veriyor tekniği Mikroelektronlar aksinedışarı mekanik biyofilm rahatsız. Ancak, bakım biyofilm ekstra ve hücre içi bölmeleri arasında doğru ayrım alınmalıdır. Burada, rasyometrik boya seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) karboksilik asit (Cı-SNARF-4) bilinmiyor türleri, bileşimin in vivo büyümüş diş biyofilmlere ekstrasellüler pH izlemek için kullanılır. boya glukoz maruz kaldığında kadar konsantre Biyofilmlererde tüm bakteri hücrelerinin içinde olduğunu; Böylece, bir genel bakteriyel leke gibi ekstrasellüler pH bir göstergesi olarak kullanılır edilir. odaklı mikroskopik görüntü kazanılmasından sonra, bakteriyel biyokütle sadece ekstrasellüler pH değerini hesaplamak için izin dijital görüntü analiz yazılımı kullanarak tüm resimlerin kaldırılır. rasyometrik boya ile pH ratiometry 75'e um kalınlıkta ince biyofilmler hücre dışı pH çalışması için çok uygundur, ama 4.5 ila 7.0 arasında bir pH aralığı ile sınırlıdır.
Introduction
Burada açıklanan yöntem rasyometrik boya (ve-6) karboksilik asit (Cı-SNARF-4) konfokal lazer tarama mikroskobu ile kombinasyon halinde kullanım ve seminaphthorhodafluor-4F 5-, 4.5 ve 7 arasında aralık diş biyofilm hücre dışı pH değerine sağlar dijital görüntü analizi. Kullanılan floresan boya pH-duyarlı ve protonasyon durumuna bağlı olarak floresan emisyonunda bir kayma gösterir. 580 nm'de protonlanmış molekül zirveleri floresan emisyon ve 640 nm 1'de deprotone molekülün emisyonu. iki emisyon değerlerinde soğurum pikleri içeren, iki algılama pencere floresan emisyonu yoğunluklarının oranı (576-608 nm ve 629-661 nm) bu şekilde bağımsız olarak, boya konsantrasyonu, sıvı fazda pH yansıtır. ~ 6.4 bir pKa ile boya orta asidik ortamlarda pH görselleştirmek için uygundur.
Bakteriyel Biyofilmlererde PH tüm metabolik işlemler için merkezi öneme sahiptir.Diş biyofilm durumunda, hücre dışı matris içinde pH diş çürüğünün gelişimi için önemli bir virülans faktörü olduğu. Biyofilm-diş arayüzü kurşun düşük pH süreleri uzatıldı altta yatan emaye 2 deminerlizasyonunu yavaş. Nedeniyle organik asitler de dahil olmak üzere biyofilm, metabolitler, karmaşık üç boyutlu mimari, eşit biyofilm dağılmış değil. Son derece az acidogenic microenvironments yakın uzamsal yakınlık 3 bulunabilir.
On yıllardır, biyofilm dikey pH geçişlerini Mikroelektronlar 4-6 yardımıyla kaydedildi. onlar nedeniyle küçük uç boyutu iyi uzaysal çözünürlüğü sunarken, yatay geçişlerini izlemek için çok uygun değildir. Ayrıca, elektrodun ekleme mekanik biyofilm rahatsız ediyor. Nicel floresan mikroskobik teknikler, mekanik müdahale olmaksızın bir biyofilm farklı alanlarda pH değişiklikleri görselleştirme avantajı sunuyoruznce. Farklı bakış mikroskobik alanları serbestçe seçilmiş ve uzun süre 1,7-9 üzerinde tekrar tekrar görüntülenebilir. mikroskopik biyofilm görüntüleri yorumlanırken Ancak, hücre dışı alana kaynaklanan Mikrobiyal biyokütle ve floresan kaynaklanan floresan ayırt etmek önemlidir. Bakteriler aktif adenosin trifosfat 10 pahasına hücre membranından proton taşınması gibi asidik koşullar altında, bakteri hücreleri içinde, pH, hücre dışı matris içinde pH farklıdır. Düşük dışı pH demineralizasyon neden ise diş çürüğü bağlamında, hücre içi bakteri pH altında yatan mine üzerinde doğrudan bir etkisi yoktur. bakteri serbest alanlar ve bakteriler hem ihtiva mikroskobik görüntüleri pH Ortalaması hatalı sonuçlara yol açar. bakteriyel biyokütle görselleştirmek ve ekstra ve hücre içi alanlar arasında ayrım yapmak amacıyla pH duyarlı boya ile birlikte diğer lekeleri kullanımı ab getiriyorekstraselüler alan floresan kirlenme ve yanlış ölçümlere 11 riski dışında.
bu yazıda, bu nedenle, bir çift işlev rasyometrik boya kullanımını tarif eder; pH belirteci olarak ve evrensel bir bakteri leke olarak hem. boya bakteri hücrelerinde konsantre kadar olduğu gibi, konfokal mikroskopik görüntüleme kombinasyonu ve doğru bir dijital görüntü analizi prosedürü ince diş Biyofilmlererde 4.5 ila 7.0 aralığında dışı pH tayininde sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektrod veya mikroelektrot ölçümler 4-6 ile karşılaştırıldığında biyofilm pH mikroskopik gözlem, birçok avantaj sağlar. Mikroskopik teknikler yüksek uzaysal çözünürlüğü ile pH'ı belirlemek ve mekanik biyofilm bozmadan Biyofilmlererde yatay hem de dikey pH gradyanları yakalama izin izin verir. Mikroskobik pH monitorizasyonu Önceki girişimler, ancak, biyofilm 1,7,9 hücre dışı ve hücre içi pH ayırt başarısız oldu. Bakteriyel homeostaza, hücre içi pH dışı p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar verimli tartışmalar için Javier E. Garcia ve teknik yardım için Lene Grönkjaer ve Merete K. Raarup teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Aarhus Üniversitesi Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi ve Simon Vakfı Spies.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
