Ici, un protocole est présenté pour identifier Kinesin-1 cargaisons. Un mutant sans moteur du Kinesin-1 chaîne lourde (KIF5B) agrège dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons. Les deux granulats sont détectés au microscope à fluorescence. Une stratégie similaire peut être utilisée pour identifier d'autres protéines cargos à moteur.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinésine-1 est une protéine de moteur qui médie le transport antérograde de ses cargaisons 1,2. Il est un hétérotétramère des deux sous-unités de la chaîne Kinesin Light 1 (KLC1) et deux sous-unités de chaînes Kinesin lourds (KHCs). KIF5B 1, un KHC, contient un domaine de moteur à son extrémité N-terminale, qui hydrolyse l'ATP et convertit l'énergie chimique en énergie mécanique pour effectuer un mouvement le long des microtubules. La région C-terminale contenant le domaine de dimérisation qui interagit avec KLC1, qui associe à cargaisons. Kinésine-1 transporte des cargaisons telles que des vésicules, des organelles et 3,4 ARNm. Récemment, KIF5B a été montré pour le transport du facteur de transcription nucléaire, c-MYC protéosomale la dégradation dans le cytoplasme 5. Trois méthodes (inhibiteur chimique, siRNA / shRNA et mutants dominant négatif) ont été utilisés pour inhiber la kinésine-1 fonction. Ils ont tous induit l'agrégation de c-MYC dans le cytoplasme. Pour la dernière méthode, c-MYC n'a été affectée par la negat dominanteive mutant de KIF5B, mais pas celle d'une autre protéine apparentée kif5a moteur, ce qui suggère que le mutant n'exerce des effets généraux sur les composants intracellulaires (tels que la perturbation des microtubules) ou sur l'agrégation des protéines. Le mutant dominant négatif de KIF5B aussi n'a pas affecté un autre facteur de transcription, ce qui suggère qu'il n'exerce des effets généraux sur les facteurs de transcription. Elle suggère plutôt que le mutant dominant négatif exerce des effets spécifiques sur ses cargaisons.
L'utilisation de mutants négatifs dominants est courant dans le domaine des protéines motrices. mutants sans moteur similaires de kinésines et myosines ont été utilisés précédemment. Ils ont été principalement utilisés pour démontrer les effets des mutants sur les localisations subcellulaires de leurs cargaisons ou sur les fonctions cellulaires 6-12. Moins l'accent a été mis sur la relation spatiale entre les mutants et les cargos touchés par eux. Toutefois, dans certains incidents, les mutants ont été observés pour co-localiser avec leur caRGOS 6,10.
L'interaction entre KIF5B et ses protéines associées a déjà été confirmée par la levure in vivo de dosage à deux hybrides et biochimiques analyses déroulants telles que la co-immunoprécipitation et essais in vitro déroulants 13-16. Dans cet article, une méthode utilisant la microscopie à fluorescence visuelle supplémentaire est décrit pour identifier les protéines de fret KIF5B. Le procédé fait usage d'un mutant de KIF5B sans moteur qui agit en tant que mutant négatif dominant. Il regroupe dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons.
Le marquage de type sauvage et mutant KIF5B sans moteur avec la protéine fluorescente tdTomato 17 permet leur visualisation par microscopie à fluorescence. Les protéines de KIF5B marqués peuvent être co-exprimés avec une protéine candidate fusionnée à une protéine fluorescente différente ayant des propriétés spectrales séparées de façon appropriée la balise KIF5B. Les protéines marquées sont observées directement dans les cellules vivantessous microscopie à fluorescence. L'induction de l'agrégation de la protéine candidate par le mutant sans moteur KIF5B confirme que la protéine candidate est un cargo de KIF5B in vivo. En outre, les protéines de KIF5B tdTomato marqués peuvent être exprimés seuls dans les cellules pour étudier leurs effets sur les protéines cargos endogènes. Par la suite, la microscopie d'immunofluorescence est réalisée dans lequel les cellules transfectées sont fixées et colorées avec un anticorps spécifique contre la protéine candidat endogène, suivi d'un anticorps secondaire approprié conjugué à un colorant fluorescent. Dans ce cas, la protéine candidate endogène à son niveau physiologique est étudié. mutants sans moteur similaires d'autres protéines motrices peuvent être préparés à identifier leurs cargaisons.
Le procédé décrit utilise les propriétés du mutant KIF5B sans moteur, qui n'a pas la capacité de se déplacer le long des microtubules, mais conserve la capacité de former des dimères avec le KIF5B de type sauvage et, de ce fait, permettre à la protéine tétramérique pour interagir avec les mêmes protéines cargo comme le type sauvage KIF5B. KIF5B sans moteur, par conséquent, agit comme un mutant dominant négatif et formes mislocalized agrège avec ses cargaisons. Cette méthode a fait ses preuves pour identifier la kinésine-1 cargaison c-myc (Figure 1) 5. Dans cet article, le même mutant KIF5B sans moteur a été utilisé pour identifier p53 comme une autre cargaison potentielle de Kinesin-1 (Figure 2). Ceci montre que la méthode est possible d'identifier d'autres chargements de la kinésine-1. En outre, la spécificité du mutant est assurée par l'absence d'effet du mutant de la protéine de régulation négative de c-Fos (Figure 3).
Dans ce protocole, l'tdTomato marqués wild-tyPE ou protéine KIF5B sans moteur est co-exprimé avec une autre protéine cargo candidat protéine marqué fluorescent. Dans ce cas, la microscopie par fluorescence des cellules vivantes et l'imagerie est effectuée. La formation des agrégats peut être tracée par imagerie time-lapse. En variante, la protéine à marquage tdTomato est exprimée seule et la protéine cargo candidat à son niveau physiologique est visualisé par microscopie à immunofluorescence indirecte en utilisant des anticorps spécifiques. TdTomato la protéine fluorescente est choisie pour son éclat et 17 photostabilité. Si le fond est élevé en raison de l'auto-fluorescence du milieu DMEM complet, milieu sans rouge de phénol est utilisé.
Le mutant KIF5B motorless forme des dimères avec le type sauvage KIF5B stoechiométriquement. Par conséquent, il est essentiel d'exprimer une quantité suffisante de mutant KIF5B sans moteur pour former des dimères avec la contrepartie de type sauvage pour inhiber son fonctionnement et à former des agrégats. Pour résoudre ce problème, l'optimisation de expression du mutant sans moteur est essentiel. Il est réalisé en utilisant une petite mutant sans moteur contenant le domaine de dimérisation. En outre, l'optimisation du réactif de transfection approprié et le protocole est également nécessaire. La durée de l'incubation des cellules HeLa avec le réactif DNA / transfection a été optimisé dans les cellules HeLa pour l'expression de protéines exogènes et la viabilité des cellules. La durée d'incubation peut être optimisé pour d'autres lignées cellulaires.
Pour des grossissements entre 4X à 40X, pas de verres de couverture sont nécessaires. Les cellules peuvent être directement examinés dans les puits. Par conséquent, dans ce cas, le protocole est peu coûteuse et commode. Pour grossissement 40X ci-dessus, les cellules sont cultivées sur des lamelles dans les puits et, après coloration, sont montés sur des lames de microscope à l'examen d'objectifs à immersion.
Observation d'agrégats de la protéine KIF5B sans moteur est limitée par la taille du cytoplasme. Il est aisé de détecter laagrégats de cellules de mammifères. Cependant, il est relativement difficile d'observer les agrégats de cellules neuronales lorsque le volume du cytoplasme est faible autour des noyaux et dans les neurites.
Le protocole est utilisé pour montrer le lien entre KIF5B et ses cargaisons en plus de l'in vivo deux hybrides de levure et biochimiques analyses déroulants 13-16. Tous ces tests déterminent l'association dans différentes conditions physiques et leurs résultats peuvent se compléter mutuellement. En outre, l'avantage de ce test de fluorescence par rapport aux autres tests est qu'il peut montrer la régulation de la localisation subcellulaire des cargaisons par KIF5B (figures 1 et 2).
Le protocole ne se limite pas à KIF5B et peut être utilisée pour identifier d'autres protéines cargos à moteur, tels que d'autres moteurs kinésine 3 et une partie des moteurs de myosine 23,24 utilisées dans le transport intracellulaire de cargaisons 3. Ces protéines motrices contiennent également des domaines moteurs pour le mouvement le long des microtubules pour les moteurs de kinésine et microfilaments pour les moteurs de myosine, et segments bispirales pour oligomérisation. La plupart d'entre eux forment des homodimères 3,23. Par conséquent, une stratégie similaire peut être appliqué à eux en créant leurs sans moteur mutants négatifs dominants d'identifier leurs cargaisons.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |