Her er en protokol forelægges identificere kinesin-1 ladninger. En motorless mutant af kinesin-1 tung kæde (KIF5B) aggregater i cytoplasmaet og inducerer sammenlægning af sine laster. Begge aggregater opdages under fluorescensmikroskopi. En lignende strategi kan anvendes til at identificere laster af andre motordrevne proteiner.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 er en motor protein, der medierer anterograd transport af sine laster 1,2. Det er en heterotetramer af de to underenheder af kinesin Light Chain 1 (KLC1) og to underenheder af kinesin tunge kæder (KHCs). KIF5B 1, en KHC, indeholder en motor domæne ved N-terminalen, der hydrolyserer ATP og omdanner kemisk energi til mekanisk energi bevægelse langs mikrotubuli til. Dens C-terminale region indeholder dimeriseringsdomænet der interagerer med KLC1, der associerer med laster. Kinesin-1 transporterer ladninger såsom vesikler, organeller og mRNA'er 3,4. For nylig KIF5B blev vist at transportere den nukleare transkriptionsfaktor c-MYC for proteosomal nedbrydning i cytoplasmaet 5. Tre metoder (kemisk inhibitor, siRNA / shRNA og dominant negativ mutant) blev anvendt til at inhibere kinesin-1 funktion. De alle aggregering af c-MYC i cytoplasmaet. For den sidste metode blev c-myc kun påvirket af den dominerende negative mutant af KIF5B, men ikke ved en anden beslægtet KIF5A motor protein, hvilket antyder, at mutanten ikke udøver generelle virkninger på de intracellulære komponenter (som mikrotubulus forstyrrelser) eller på protein aggregation. Den dominante negative mutant af KIF5B også påvirkede ikke anden transskriptionsfaktor, hvilket antyder, at det ikke udøver generelle virkninger på transkriptionsfaktorer. Tværtimod foreslog, at den dominerende negative mutant udøver særlige virkninger for sine laster.
Anvendelsen af dominante negative mutanter er almindeligt på området for motordrevne proteiner. Lignende motorless mutanter af kinesiner og myosiner blev anvendt tidligere. De blev hovedsageligt anvendt til at demonstrere effekten af mutanterne på de subcellulære lokaliseringer af deres last eller på cellulære funktioner 6-12. blev lagt mindre vægt på det rumlige forhold mellem mutanter og er berørt af dem laster. Men i nogle forekomster blev mutanterne observeret at co-lokalisere med deres cargos 6,10.
Samspillet mellem KIF5B og dens tilknyttede proteiner er tidligere blevet bekræftet ved de vivo gær to-hybrid assay og biokemiske pull-down assays, såsom co-immunopræcipitation og in vitro pull-down assays 13-16. I denne artikel er en ekstra visuel metode ved hjælp af fluorescens mikroskopi beskrevet at identificere KIF5B fragt proteiner. Fremgangsmåden gør brug af en motorless KIF5B mutant, der fungerer som en dominant negativ mutant. Det aggregater i cytoplasmaet og inducerer sammenlægning af sine laster.
Tagging af vildtype og motorless KIF5B mutant med det fluorescerende protein tdTomato 17 muliggør deres visualisering ved fluorescensmikroskopi. De taggede KIF5B proteiner kan co-udtrykkes med en kandidat-protein fusioneret til et andet fluorescerende protein med spektrale egenskaber separeres hensigtsmæssigt fra KIF5B tag. De mærkede proteiner observeres direkte i levende cellerunder fluorescensmikroskopi. Induktion af sammenlægning af kandidat protein ved motorless KIF5B mutant bekræfter, at kandidaten protein er pt in vivo last af KIF5B. Endvidere kan tdTomato-mærkede KIF5B proteiner udtrykkes alene i cellerne for at studere deres virkninger på de endogene fragt proteiner. Senere bliver immunfluorescensmikroskopi udført, hvorved de transficerede celler fikseret og farvet med et specifikt antistof mod det endogene kandidat-proteinet, efterfulgt af en passende sekundært antistof konjugeret med et fluorescerende farvestof. I dette tilfælde er det endogene kandidat protein ved dets fysiologiske niveau undersøgt. Lignende motorless mutanter af andre motoriske proteiner kan være parat til at identificere deres last.
Den beskrevne fremgangsmåde anvender egenskaberne af motorless KIF5B mutant, som mangler evnen til at bevæge sig langs mikrotubuli, men bevarer evnen til at danne dimerer med vildtype KIF5B og derved tillade den tetramere protein til at interagere med de samme lastproteiner som vildtype KIF5B. Motorless KIF5B derfor virker som en dominerende negativ mutant og former mislocalized aggregater med sine laster. Denne metode har vist sig at identificere kinesin-1 fragt c-MYC (figur 1) 5. I denne artikel, blev den samme motorless KIF5B mutant bruges til at identificere p53 som en anden potentiel last af kinesin-1 (figur 2). Dette viser, at metoden er muligt at identificere andre laster af kinesin-1. Endvidere er specificiteten af mutanten tilvejebringes af manglende virkning af den mutante på den negative kontrol protein C-Fos (figur 3).
I denne protokol, den tdTomato-mærkede vilde type eller motorless KIF5B protein co-udtrykkes med et andet fluorescerende protein-mærkede kandidat fragt protein. I dette tilfælde er live-cell fluorescensmikroskopi og billeddannelse udføres. Dannelsen af aggregaterne kan spores ved time-lapse billeddannelse. Alternativt tdTomato-taggede protein udtrykt alene og kandidaten fragt protein ved dets fysiologiske niveauer visualiseres ved indirekte immunfluorescens mikroskopi under anvendelse af specifikke antistoffer. Den fluorescerende protein tdTomato er valgt for sin lysstyrke og fotostabilitet 17. Hvis baggrunden er høj på grund af autofluorescens af det komplette DMEM medium, medium uden phenolrødt anvendes.
Den motorless KIF5B mutantformer dimerer med vildtype-KIF5B støkiometrisk. Derfor er det afgørende at udtrykke en tilstrækkelig mængde af motorless KIF5B mutant at danne dimerer med vildtype-modstykke til at inhibere dens funktion og til at danne aggregater. For at løse dette problem, optimering af expression af motorless mutanten er afgørende. Det opnås ved hjælp af en lille motorless mutant indeholdende dimeriseringsdomænet. Desuden optimering af den passende transfektionsreagens og protokollen er også nødvendig. Varigheden af inkubationen af HeLa-celler med DNA / transfektion reagens blev optimeret i HeLa-celler til ekspression af exogene proteiner og cellelevedygtighed. Inkubationen varighed kan være nødvendigt at være optimeret til andre cellelinjer.
For forstørrelser mellem 4X til 40X, er der ingen dækning briller påkrævet. Celler kan direkte undersøges i brøndene. Derfor, i dette tilfælde protokollen er billig og praktisk. For forstørrelser over 40X dyrkes celler på dækglasset i brøndene, og efter farvning, er monteret på objektglas til undersøgelse under olie-nedsænkning mål.
Observation af aggregater af den motorless KIF5B protein er begrænset af størrelsen af cytoplasmaet. Det er let at detektereaggregater i mange pattedyrsceller. Imidlertid er det relativt svært at observere aggregater i neuronale celler, når salget af cytoplasmaet er lille omkring kernerne og i neuritter.
Protokollen benyttes til at vise sammenhængen mellem KIF5B og dets last ud over den in vivo gær to-hybrid og biokemiske pull-down assays 13-16. Alle disse analyser bestemme foreningen under forskellige fysiske forhold og deres resultater kan supplere hinanden. Endvidere fordelen ved denne fluorescens assay i forhold til andre assays er, at det kan vise reguleringen af subcellulær lokalisering af laster ved KIF5B (figur 1 og 2).
Protokollen er ikke begrænset til KIF5B og kan bruges til at identificere laster af andre motordrevne proteiner, såsom nogle andre kinesin motorer 3 og nogle af myosin motorerne 23,24 anvendt i intracellulær transport af laster 3. Disse motordrevne proteiner indeholder også motordrevne domæner bevægelse langs mikrotubuli til kinesin motorer og mikrofilamenter for myosin motorer og coiled-coil-segmenter til oligomerisering for. De fleste af dem danner homodimerer 3,23. Derfor kan en tilsvarende strategi anvendes på dem ved at skabe deres motorless dominerende negative mutanter for at identificere deres last.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |