Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray
Summary
Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Antilichaam microarrays zijn op grote schaal gebruikt in proteomics studies decennia de aanwezigheid van gerichte eiwitten, waaronder eiwitten biomarkers 1-3 onderzocht. Hoewel dit gebied die momenteel wordt geconfronteerd met grote uitdagingen van andere high-throughput technologieën zoals massaspectrometrie (MS), is er nog voldoende ruimte voor het nut van antilichaam microarrays, vooral omdat deze apparaten veroorloven eenvoudige interpretatie van de gegevens en gemakkelijke interface met andere testen. De afgelopen jaren is de integratie van microarrays in microchip scaffolds mits het antilichaam microarray een nieuwe kans te gedijen 4-7. Zo heeft de barcode microarray geïntegreerd in een single-cell chip is gebruikt in mobiele communicatie studies 8,9. Deze technologie heeft onderscheidende voordelen boven andere beschikbare microarray technologie. Het beschikt arrayelementen op 10-100 um, veel kleiner dan de typische 150 urn size in gebruikelijke microarray elements. De constructie van kleinere arrayelementen wordt bereikt door systematisch flow patronen benaderingen, en dit geeft aanleiding tot compact microarrays die eencellige uitgescheiden eiwitten en intracellulaire eiwitten kan detecteren. Een ander voordeel is het gebruik van een eenvoudige, instrument set-up. Dit is vooral belangrijk, omdat de meeste laboratoria en kleine bedrijven kunnen niet in staat zijn om toegang te krijgen tot microarray kernfaciliteiten. Dergelijke barcode antilichaam microarrays uitgevoerd met verbeterde doorvoer assay en kunnen worden gebruikt om zeer multiplex assays op enkele cellen terwijl het bereiken van een hoge gevoeligheid en specificiteit vergelijkbaar met die van conventionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA 8). Deze technologie heeft talrijke toepassingen gevonden in het opsporen van eiwitten uit glioblastoma 9-11, T-cellen 12 en circulerende tumorcellen 13. Als alternatief, barcode DNA microarrays alleen zijn gebruikt in de nauwkeurige positionering van neuronen en astrocyten voor nabootsening de in vivo assemblage van hersenweefsel 14.
Dit protocol alleen gericht op de experimentele stappen en opbouw blokken van de tweedimensionale (2D) streepjescode antilichaam microarray die potentiële toepassingen bij de detectie van biomarkers in vloeibare monsters heeft en in enkele cellen. De technologie is gebaseerd op adresseerbare enkelstrengig, eendimensionale (1-D) DNA microarray geconstrueerd met oligonucleotiden die orthogonaal ruimtelijk patroon op glassubstraten. De 1-D wordt gevormd als evenwijdige stromingskanalen worden toegepast in de stroom-patroonvormingsstap en dergelijk patroon weergegeven als discrete banden visueel vergelijkbaar 1-D Universal Product Code (UPC) barcodes. De constructie van een 2-D (n x m) antilichaam matrix – doet denken aan een 2-D Quick Response (QR) matrixcode – dient complexer patroon strategieën, maar maakt de immobilisatie van antilichamen met een hogere dichtheid 8,15. De fabricagevereist twee DNA patroonvormende stappen, de eerste patroon loodrecht op de tweede. De snijpunten van deze twee patronen vormen de n x m elementen van de array. Door strategische keuze van de reeksen van enkelstrengs DNA (ssDNA) gebruikt in flow-patroonvorming, is elk element in een bepaalde rij een specifiek adres toegewezen. Deze ruimtelijke referentie is noodzakelijk onderscheid tussen fluorescentiesignalen op de microarray dia. De ssDNA matrix wordt omgezet in een antilichaam matrix door de integratie van complementaire DNA-antilichaam conjugaten, waarbij een platform genaamd DNA gecodeerde bibliotheek antilichaam (DEAL 16).
Deze video protocol beschrijft de belangrijkste stappen in het creëren van nxm antilichaam-arrays, die onder meer het opstellen van polydimethylsiloxaan (PDMS) barcode mallen, stroom-patroonvorming ssDNA in twee oriëntaties, het voorbereiden van antilichaam-oligonucleotide DEAL conjugaten, en het omzetten van de 3 x 3 DNA-array de een 3x 3 antilichaam array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stromingspatroon ontwerp is de eerste cruciale stap in het vervaardigen van de 2-D microarray. Twee overlappende DNA patronen op een glassubstraat te genereren, moet het kanaal kenmerken van het eerste ontwerp loodrecht op die van de tweede (Figuur 1A-B) zijn. De ontwerpen ook rekening met de downstream-toepassingen van de microarray. Bij enkele cel analyse wordt de microarray gebruikt om eiwitten van enkelvoudige cellen ingesloten in microkamers detecteren daarom kanaal afmetingen verenigbaar …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
Referências
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
