高密度バーコード抗体マイクロアレイのフローパターンガイド作製
Summary
このプロトコルは、細胞シグナル伝達研究やバイオマーカー検出の潜在的なアプリケーションと大規模の製造、多重化された二次元のDNAまたは抗体配列を、概要を説明します。
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
抗体マイクロアレイは、広くタンパク質バイオマーカー1-3を含む標的タンパク質の存在を調べるために何十年もプロテオミクス研究に使用されています。このフィールドは現在、質量分析（MS）のような他のハイスループット技術から大きな課題に直面しているが、これらのデバイスは、他のアッセイと、単純なデータ解釈と簡単なインターフェイスを提供する主な理由は、まだ抗体マイクロアレイの有用性の余地があります。近年では、マイクロチップの足場へのマイクロアレイの統合は、抗体マイクロアレイを4-7を繁栄するための新しい機会を提供してきました。例えば、単一の細胞マイクロチップに組み込まれたバーコードのマイクロアレイは、細胞コミュニケーション研究8,9で使用されています。この技術は、他の利用可能なマイクロアレイ技術上の独特の利点を有します。従来のマイクロアレイelemenで使用される典型的な150μmのサイズよりもはるかに小さい10-100ミクロンで配列要素を備えていTS。より小さな配列要素の構造は、系統的なフローパターン化手法を用いて達成され、これは、単一細胞の分泌タンパク質及び細胞内タンパク質を検出することができるコンパクトなマイクロアレイを生じます。もう一つの利点は、単純な楽器フリーのセットアップを使用することです。ほとんどの研究所や中小企業は、マイクロアレイコア施設にアクセスすることができないかもしれないので、これは特に重要です。このようなバーコードの抗体マイクロアレイは、強化されたアッセイのスループットを備え、従来のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA 8）のそれに匹敵する高い感度と特異性を達成しながら、単一の細胞上に高度に多重化されたアッセイを実行するために使用することができます。この技術は、腫瘍細胞の13膠芽細胞腫9-11からのタンパク質、T細胞12を検出し 、そして循環中の多数のアプリケーションを発見しました。あるいは、単独でバーコードDNAマイクロアレイは、模倣のために、ニューロンおよび星状細胞の正確な位置決めに利用されています脳組織14 の in vivoでのアセンブリをる。
このプロトコルは、実験工程と、流体試料中の単一細胞中のバイオマーカーの検出において潜在的な用途を有する二次元（2-D）バーコード、抗体マイクロアレイの構築ブロックに焦点を当てます。技術は、アドレス可能な一本鎖、一次元（1-D）DNAマイクロアレイに基づいてガラス基板上に、空間的にパターニングされた直交するオリゴヌクレオチドを用いて構築しました。並列流路を流れパターニング工程において使用される場合、1次元パターンが形成され、このようなパターンは、1-D統一商品コード（UPC）バーコードと視覚的に類似した離散的なバンドとして現れます。 2-Dの建設（N×M個）抗体アレイ- 2-Dクイックレスポンス（QR）マトリックスコードを連想させるには-より複雑なパターン化戦略を必要とするが、より高い密度8,15での抗体の固定化を可能にします。製作第二に垂直な第一のパターンで、二つのDNAパターニング工程を必要とします。これらの二つのパターンの交点は、アレイのn個のx m個の要素を構成しています。戦略フローパターニングに利用一本鎖DNA（ssDNA）の配列を選択することにより、所与の配列内の各要素は、特定のアドレスが割り当てられます。この空間参照は、マイクロアレイスライド上の蛍光シグナルを区別する必要です。一本鎖DNA配列をDNAにコードされた抗体ライブラリー（DEAL 16）と呼ばれるプラットフォームを形成し、相補的DNA抗体コンジュゲートの取り込みを介して抗体の配列に変換されます。
このビデオプロトコルは、2つの方向で準備を含むn×m個抗体アレイポリジメチルシロキサン（PDMS）、バーコードの型、フロー・パターニングのssDNAを作成し、抗体-オリゴヌクレオチドディール複合体を調製し、3に3×3のDNA配列を変換する際に重要なステップを説明×3抗体アレイ。
Protocol
Representative Results
Discussion
フローパターン設計は、2-Dのマイクロアレイの製造における最初の重要なステップです。ガラス基板上に2つの重複DNAパターンを生成するために、最初の設計のチャネルの特徴は、第二の（ 図1A-B）のものに対して垂直であるべきです。デザインはまた、マイクロアレイの下流の適用を検討してください。単一細胞分析の場合には、マイクロアレイは、したがって、チャネ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
Referências
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