Flow-mønster Guidet Fabrikasjon av høy tetthet Barcode Antistoff Microarray
Summary
Denne protokollen skisserer fabrikasjon av en storstilt, multiplekset todimensjonal DNA eller antistoff array, med potensielle bruksområder i cellesignale studier og biomarkør gjenkjenning.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Antistoff mikromatriser har blitt mye brukt i proteomikk studier i flere tiår for å undersøke tilstedeværelse av målrettede proteiner, inkludert protein biomarkører 1-3. Selv om dette feltet er i dag overfor store utfordringer fra andre high-throughput teknologier som massespektrometri (MS), er det fortsatt god plass for nytten av antistoff mikromatriser, hovedsakelig fordi disse enhetene råd enkel tolking og enkelt grensesnitt med andre analyser. I de senere årene har integreringen av mikromatriser inn microchip stillaser gitt antistoffet microarray en ny mulighet til å trives 4-7. For eksempel har strekkode microarray integrert i en encellet mikrobrikke blitt brukt i celle kommunikasjon studier 8,9. Denne teknologien har særegne fordeler fremfor andre tilgjengelige microarray teknologi. Det har array elementer på 10-100 mikrometer, mye mindre enn den typiske 150 mikrometer størrelsen som brukes i konvensjonelle microarray elets. Konstruksjonen av mindre oppstillingselementene oppnås ved hjelp av systematiske strømningsmønster nærmer seg, og dette gir opphav til kompakte mikromatriser som kan oppdage encellet utskilte proteiner og intracellulære proteiner. En annen fordel er bruken av en enkel, instrument-fri oppsett. Dette er spesielt viktig, fordi de fleste laboratorier og små selskaper ikke kan være i stand til å få tilgang microarray kjernefasiliteter. En slik strek antistoff mikromatriser funksjonen forbedret assay gjennomstrømming, og kan brukes til å utføre analyser på multipleksede meget enkle celler samtidig oppnå høy sensitivitet og spesifisitet sammenlignes med den for konvensjonell sandwich-enzymbundet immunosorbent assay (ELISA 8). Denne teknologien har funnet en rekke programmer for å påvise proteiner fra glioblastom 9-11, T-celler 12, og sirkulerende tumorceller 13. Alternativt strekkode DNA-mikromatriser alene er blitt anvendt i nøyaktig posisjonering av neuroner og astrocytter for mimicking in vivo sammenstillingen av hjernevev 14.
Denne protokollen fokuserer bare på de eksperimentelle skritt og bygge opp blokker av to-dimensjonale (2D) strekkode antistoff microarray som har potensielle bruksområder i påvisning av biomarkører i fluidic prøver og i enkeltceller. Teknologien er basert på et adresserenkeltrådet, endimensjonale (1-D) DNA microarray konstruert ved hjelp av ortogonale oligonukleotider som er mønstret romlig på glass underlag. Den 1-D mønsteret er dannet når parallelle strømningskanaler blir brukt i strømningsmønstertrinn, og et slikt mønster fremstår som adskilte bånd visuelt ligner på en D-Universal Product Code (UPC) strekkoder. Konstruksjonen av et 2-D (n x m) antistoff-gruppe – som minner om en 2-D Rask respons (QR) matrise-kode – behov for mer kompliserte mønster strategier, men gjør det mulig for immobilisering av antistoffer på en høyere tetthet 8,15. Fabrikasjonkrever to DNA mønstringstrinn, med det første mønsteret vinkelrett på den andre. Krysningspunkt mellom disse to mønstrene danner de n x m elementene i matrisen. Ved strategisk å velge sekvensene av enkelt-trådet DNA (ssDNA) anvendes i flow-mønster, blir hvert element i en gitt matrise tilordnes en bestemt adresse. Denne romlige referanse er nødvendig å skille mellom fluorescenssignaler på microarray lysbildet. SsDNA matrisen omdannes til et antistoff matrise gjennom inkorporering av komplementære DNA-antistoff-konjugater, som danner en plattform som kalles DNA-kodede antistoff-bibliotek (DEAL 16).
Denne videoen protokollen beskriver de viktigste trinnene i å skape NxM antistoff arrays som inkluderer forbereder polydimethylsiloxane (PDMS) strekkode muggsopp, flow-mønster ssDNA i to retninger, forbereder antistoff-oligonukleotid DEAL konjugater, og konvertere den 3 x 3 DNA array i et trex 3 antistoff array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strømningsmønsteret utforming er den første kritiske trinn i fremstilling av 2-D microarray. For å generere to overlappende DNA-mønster på et glass-substrat, bør kanal trekk ved den første konstruksjon være vinkelrett på de i den andre (Figur 1A-B). Designene også vurdere nedstrøms anvendelser av microarray. I tilfelle av enkeltcelleanalyse, blir brukt til å detektere mikromatriseproteiner fra enkeltceller innesluttet i microchambers derfor dimensjonene kanal gjøres forenlig med d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
Referências
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
