Поток-модель Руководствуясь Изготовление высокой плотности штрих-кода антител Microarray
Summary
Этот протокол описывает изготовление больших масштабах, мультиплексированных двумерный ДНК или антител массив, с потенциальными приложений в сигнальных исследований клеток и выявления биомаркеров.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Антитела микрочипов были широко использованы в протеомическим исследований в течение многих десятилетий, чтобы исследовать присутствие целевых протеинов, в том числе белковых биомаркеров 1-3. Хотя это поле в настоящее время сталкивается с серьезными проблемами из других технологий высокой пропускной такие как масс-спектрометрии (МС), есть еще много места для утилиты микрочипов антител, в основном потому, что эти устройства позволить себе простую интерпретацию данных и удобный интерфейс с другими анализами. В последние годы, интеграция микрочипов в микрочип лесов предоставил антитело микрочипов новую возможность процветать 4-7. Например, штрих-код микрочипов интегрированы в одноклеточного микрочипа был использован в исследованиях 8,9 сотовой связи. Эта технология имеет свои отличительные преимущества перед другими доступными технологиями микрочипов. К услугам гостей элементы массива в 10-100 мкм, намного меньше, чем типичный 150 мкм размер, используемый в обычных микрочипов ElemenTS. Строительство небольших элементов массива достигается с помощью систематических подходов потока паттерна, и это приводит к компактных микрочипов, которые могут обнаружить одноклеточного секретируемые белки и внутриклеточные белки. Еще одним преимуществом является использование простого прибора, свободной установки. Это особенно важно, потому что большинство лабораторий и небольшие компании не могут иметь доступ к микрочипов основные средства. Такой штрих-микрочипов антител функция расширенного анализа пропускной способности и может быть использован для выполнения чрезвычайно мультиплексированных анализов на отдельные клетки при достижении высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой с обычной сэндвич иммуноферментного анализа (ELISA) 8. Эта технология нашла широкое применение в выявлении белков из глиобластомы 9-11 Т-клетки 12 и циркулирующих опухолевых клеток 13. Кроме того, ДНК-чипы штрих одна были использованы в точного позиционирования нейронов и астроцитов для подражатьING сборку в естественных условиях ткани головного мозга 14.
Этот протокол фокусируется только на экспериментальных шагов и наращивание блоков двумерного (2-D) штрих-кодов микрочипов антитела, который имеет потенциальные приложения в обнаружении биомаркеров в жидкостных образцов и в одиночных камерах. Технология основана на адресуемой одноцепочечной, одномерных (1-D) микрочипов ДНК, сконструированной с использованием ортогональных олигонуклеотиды, которые узорчатые пространственно на стеклянных подложках. 1-D структура сформирована при параллельных проточных каналов используются на этапе потока узора, и такая картина выглядит как дискретные полосы визуально похожими на 1-D универсальный код продукта (UPC) штрих-кодов. Строительство массива антител в 2-D (п х м) – напоминает 2-D Быстрый ответ (QR-код) матрицы – нуждается в более сложные стратегии паттерна, но позволяет для иммобилизации антител при высокой плотности 8,15. Изготовлениетребует двух шагов паттерна ДНК, с первого рисунка перпендикулярно второму. Точки пересечения этих двух моделей представляют собой н х м элементы массива. Эффективно выбора последовательности одноцепочечной ДНК (оцДНК), используемого в проточной паттерна, каждый элемент данного массива присваивается определенный адрес. Это пространственная привязка необходима различения сигналов флуоресценции на микрочипов слайда. Массив оцДНК преобразуется в массив антител путем включения дополнительных ДНК-конъюгаты антител, образуя платформу под названием библиотеку ДНК закодированный антитела (ДЕЛО 16).
Этот протокол ролик описывает основные шаги в создании NxM массивы антител, которые включают подготовку полидиметилсилоксана (PDMS) штрих-кодов формы, поток-паттерна оцДНК в двух направлениях, подготовка антитело-олигонуклеотидных конъюгатов сделки, и преобразования массив 3 х 3 ДНК в 3х 3 массива антитела.
Protocol
Representative Results
Discussion
Шаблон потока является первым важным шагом в изготовлении 2-D микрочипов. Для генерации два перекрывающихся образцы ДНК на стеклянную подложку, особенности канале первой конструкции должны быть перпендикулярны к тем второго (фиг.1А-В). Проекты также рассмотреть вниз по те?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
Referências
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
