Flow-mönster Guidad Tillverkning av hög densitet Barcode Antibody microarray
Summary
Detta protokoll beskriver framställningen av en storskalig, multiplex tvådimensionell DNA eller antikropps array, med potentiella tillämpningar inom cellsignalering studier och biomarkör upptäckt.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Antikropps mikroarrayer har använts i stor utsträckning i proteomikstudier i decennier för att undersöka förekomsten av riktade proteiner, inklusive protein biomarkörer 1-3. Även detta område är för närvarande inför stora utmaningar från andra teknik med hög kapacitet såsom masspektrometri (MS), finns det fortfarande gott om utrymme för nyttan av microarrays antikropps, främst eftersom dessa enheter ge enkel tolkning av data och enkelt gränssnitt med andra analyser. Under de senaste åren har integrationen av microarrays i mikrochips byggnadsställningar förutsatt att antikroppen microarray en ny möjlighet att frodas 4-7. Exempelvis har streckkoden microarray integreras i en encelliga mikrochip använts i cellkommunikationsstudier 8,9. Denna teknik har distinkta fördelar jämfört med andra tillgängliga microarray teknik. Den har arrayelement på 10-100 ^ m, mycket mindre än den typiska 150 fim storlek som används i konventionella microarray elements. Konstruktionen av mindre arrayelement åstadkommes med användning av systematiska flödesmönstrings metoder, och detta ger upphov till kompakta mikromatriser som kan upptäcka encelliga utsöndrade proteiner och intracellulära proteiner. En annan fördel är att använda en enkel, instrument fri installation. Detta är särskilt viktigt, eftersom de flesta laboratorier och små företag som inte kan ha möjlighet att få tillgång till microarray core faciliteter. Sådan streckkod microarrays antikropps funktionen förbättrad analys genomströmning och kan användas för att utföra mycket multiplexerade analyser på enskilda celler och samtidigt uppnå hög känslighet och specificitet jämförbar med den för konventionellt sandwich-enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA 8). Denna teknik har ett antal användningsområden i att upptäcka proteiner från glioblastom 9-11, T-celler 12, och cirkulerande tumörceller 13. Alternativt, ensam streckkod DNA microarrays har använts i exakt positionering av nervceller och astrocyter för mimicking monteringen av hjärnvävnad 14 in vivo.
Detta protokoll fokuserar enbart på de experimentella stegen och bygga upp block av den tvådimensionella (2-D) streckkod antikroppsmicroarray som har potentiella tillämpningar inom detektion av biomarkörer i fluidprover och i enskilda celler. Tekniken bygger på en adresserbar enkelsträngad, endimensionell (1-D) DNA microarray konstrueras med hjälp ortogonala oligonukleotider som mönstrade spatialt på glassubstrat. Den 1-D-mönstret bildas när parallella flödeskanaler används i flödes-mönstringssteget, och ett sådant mönster visas som diskreta band visuellt liknar en-D Universal Product Code (UPC) streckkoder. Byggandet av en 2-D (n x m) antikropp array – påminner om en 2-D Quick Response (QR) matriskod – behöver mer komplexa mönstrings strategier, men tillåter immobilisering av antikroppar vid en högre densitet 8,15. Tillverkningenkräver två DNA-mönstringssteg, med det första mönstret är vinkelräta mot den andra. Skärningspunkterna av dessa två mönster utgör n x m element i uppsättningen. Genom att strategiskt välja sekvenserna av enkelsträngat DNA (ssDNA) som utnyttjas i flödes mönstring, är varje element i en given matris tilldelas en specifik adress. Denna rumsliga referens är nödvändigt att skilja mellan fluorescenssignaler på microarray bild. SsDNA matrisen omvandlas till en antikropp matris genom inkorporeringen av komplementära DNA-antikropp-konjugat, som bildar en plattform som kallas DNA-kodade antikroppsbibliotek (GIV 16).
Denna video protokoll beskriver de viktigaste stegen för att skapa NxM arrayer antikropps bland annat förbereder polydimetylsiloxan (PDMS) streckkod formar, flödes mönstring ssDNA i två riktningar, förbereda antikropp-oligonukleotid DEAL konjugat, och omvandla 3 x 3 DNA array i en 3x 3-antikropp matris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flödesmönsterdesign är det första kritiska steget i tillverkning av 2-D microarray. För att generera två överlappande DNA-mönster på ett glassubstrat, bör kanal särdragen hos den första utformningen vara vinkelrät mot de i den andra (Figur 1A-B). Mönstren anser också nedströms tillämpningar av microarray. I fallet med en enda cell analys, är microarray används för att detektera proteiner från enstaka celler inneslutna i microchambers, därför kanaldimensioner görs förenl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
Referências
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
