ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא בשימוש נרחב כדי להשיג הבנה טובה יותר של תפקודים תאיים בתאים חיים עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה 1. בסריג, אנרגיה מfluorophore תורם נרגש מועברת לfluorophore acceptor. סריג יעילות הוא תלוי מאוד על המרחק בין התורם fluorophore acceptor והאוריינטציה שלהם, ולכן קריאת נתונים רגישות של שינויי קונפורמציה המשפיעים על שני fluorophores. תופעה זו מנוצלת ליצירת חיישנים מבוססי סריג להדמיה של מולקולות קטנות. שינויים בריכוזם יכולים להיות במעקב עם עלייה / ירידה בשיעור של עוצמת פליטה של acceptor לעומת fluorophore התורם 2. לדוגמא, חיישני סידן מבוססי סריג מאפשרים זיהוי מהיר ויציב של ריכוזי סידן חופשיים בתאים חיים 3. יתרונות אחרים של חיישנים מבוססי סריג הם הדמיה בתאי חיים יחידים, לאיורש אינה הפולשנות, היכולת שלהם להיות ממוקד לסוגי תאים שונים ותאים סלולריים 4.
היבטים של דינמיקה של חומצות מרה תאיים רבים עדיין הם הבינו היטב. לדוגמא, מעט מאוד ידוע על בסיס תקנת המנגנון של תחבורת חומצות מרה מצומדות וunconjugated. קיימים טכניקות כדי לפקח על תחבורה זה בעיקר לעשות שימוש בכתבים מבוסס לוציפראז, חומצות מרה רדיואקטיבי, או אנלוגים של חומצות מרה ניאון. האחרון דורש שינוי של חומצות מרה, אולי משפיע על תכונותיהם. יש עיתונאים המבוסס על לוציפראז רזולוציה זמן עני. חוץ מזה, בטכניקות אלה לגרום לאובדן של המדגם ואינם ישימים להדמיה בתאים בודדים. לכן, זה יהיה מועיל להשתמש בשיטות המאפשרות הדמיה תא בודדת חי של פעילות תחבורה באמצעות חיישני סריג, במיוחד משום שהיא כוללת את היתרון של זיהוי 5 ratiometric, 6. בעוד גרסאות של CFP / טופס YFP הנפוץ ביותר בשימוש זוגות סריג, אסטרטגיות חדשות באמצעות Morange וmCherry נושא מוטציות עמותה עצמית-התרמה הובילה להרחבת ארגז הכלים סריג עם חיישני רומן, כוללים חיישן חומצות מרה אדום העביר 7.
יצרנו חיישן גנטי מקודד סריג מרה חומצה (BAS), שמורכב מfluorophore תורם (תכלת) וfluorophore acceptor (סיטרין) שהתמזגו עם תחום קולט X farnesoid (FXR) יגנד מחייב בעבר (FXR-LBD) ופפטיד המכיל מוטיב LXXLL 8. מקורבים זה פפטיד עם FXR-LBD באופן חומצה תלויה מרה. עם הפעלת FXR, המרחק בין סיטרין והתכלת ישנה עקב שינוי קונפורמציה. בשורות תאי יונקים, תוצאות FXR הפעלה בעלייה להבחין בבירור בסיטרין / היחס תכלת, בעוד החיישן המטוהר עובד בכיוון ההפוך וגורם ליחס סריג ירד על הפעלת FXR. חיישן זה (CytoBAS)מאפשר ניטור של דינמיקה של חומצות מרה cytosolic. על ידי תוספת carboxyl הטרמינל של מוטיבים מיקוד subcellular, מבנה BAS יכול להיות ממוקד לגרעין (NucleoBAS) וperoxisomes (PeroxiBAS), המאפשר מדידות של ריכוזי חומצות מרה בתאים סלולריים שונים. למרות התוספת של מוטיב מיקוד peroxisomal אינה פוגעת היענותה לחומצות מרה, FXR-ligands החדיר תאים לא לגרום לכל סריג שינויים של PeroxiBAS בתוך peroxisomes 8. כטבעו של פער זה אינו ידוע, הפרוטוקול להלן מתמקד בCytoBAS וNucleoBAS.
השימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה הודגם לאחרונה בתאים המכילים את מובילי כבד חומצות מרה Na פוליפפטיד שיתוף הובלה / taurocholate + (NTCP) ואלפא טרנספורטר המומס אורגני / בטא (OSTαβ) 8. NTCP היא היבואנית של חומצת מרה בכבד הקרן וOSTαβ הוא מרה מעיים basolateralטרנספורטר חומצה שיכול לתפקד גם כיבואן ויצואן תלוי בשיפוע של החומצות מרה אלקטרוכימיים הריכוז 9, 10. נתונים אחרונים הראו כי על תחבורת חומצות מרה על ידי NTCP ו / או OSTαβ, ניתן לצפות תגובות חזקות ומהירה ביחס סריג כתוצאה מאינטראקצית יגנד-FXR-LBD.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשיטות למדידת סריג כגון ניתוח confocal מיקרוסקופי ותא מופעל הקרינה מיון (FACS), לסמן את השלבים קריטיים, לטפל בבעיות פוטנציאליות ולדון שיטות חלופיות. שימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה, אינטראקציה עם חומצות מרה FXR-LBD ניתן לכמת ופיקוח ישיר בתאים חיים ומספקת שיטה מהירה ופשוטה של הדמיה תחבורת חומצות מרה ודינמיקה בזמן אמת. פלסמידים ביטוי יונקים קידוד CytoBAS וNucleoBAS זמינים מסחרי. לכן, biosensor זה יכול עוד לתרום להבנה של מובילי חומצות מרה או תרכובות המפעילות FXR ולספק הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של חומצות מרה ואיתות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש בחיישן של חומצות מרה רומן מקודדים גנטי מסוגל ניטור דינמיקת spatiotemporal תחבורת חומצות מרה בתאים חיים. biosensor זה מורכב מחלבוני ניאון תכלת וסיטרין שהם התמזגו לFXR-LBD, וכך יוצרים חיישן מבוסס סריג חומצות מרה (BAS).
<p class="jove_content" style=";text-align:right;di…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
Referências
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
