Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
Transfert Förster Resonance Energy (FRET) est largement utilisé pour acquérir une meilleure compréhension des fonctions cellulaires dans des cellules vivantes avec une résolution temporelle et spatiale 1. Dans FRET, de l'énergie à partir d'un fluorophore donneur excité est transférée à un fluorophore accepteur. L'efficacité de FRET dépend fortement de la distance entre le fluorophore donneur et l'accepteur et leur orientation et est donc une lecture sensible de changements conformationnels qui influent sur les deux fluorophores. Ce phénomène est exploité pour générer les biocapteurs à base de FRET pour l'imagerie de petites molécules. Des changements dans la concentration peuvent être contrôlées comme des augmentations / diminutions dans le rapport de l'intensité d'émission de l'accepteur par rapport au fluorophore donneur 2. Par exemple, les biocapteurs de calcium à base de FRET permettent pour la détection rapide et stable des concentrations de calcium libres dans les cellules 3 vivre. Autres avantages de biocapteurs basés-FRET sont l'imagerie dans les cellules de vie simples, théritier non-invasivité, leur capacité à être ciblée sur différents types de cellules et compartiments cellulaires 4.
De nombreux aspects de la dynamique des acides biliaires intracellulaire sont encore mal compris. Par exemple, on sait peu sur le mécanisme sous-jacent de la réglementation du transport des acides biliaires conjuguée et non conjuguée. Les techniques existantes pour surveiller ce transport font principalement l'utilisation de journalistes basée luciférase, les acides biliaires, radiomarqués ou fluorescentes analogues des acides biliaires. Ce dernier nécessite une modification des acides biliaires, qui pourrait affecter leurs propriétés. Reporters luciférase ont une mauvaise résolution temporelle. En outre, ces techniques se traduisent par une perte de l'échantillon et ne sont pas applicables pour l'imagerie dans des cellules individuelles. Par conséquent, il serait avantageux d'utiliser des méthodes qui permettent l'imagerie cellulaire unique en direct de l'activité de transport utilisant les biocapteurs FRET, d'autant qu'il comprend l'avantage de la détection ratiométrique 5, 6. Bien que des variantes de CFP / YFP forme la plus fréquemment utilisée paires FRET, de nouvelles stratégies en utilisant Morange et mCherry portant des mutations auto-association-induisant ont conduit à une expansion de la boîte à outils FRET avec de nouveaux capteurs, y compris un capteur d'acide biliaire décalée vers le rouge 7.
Nous avons déjà créé un FRET capteur génétiquement codé bile acide (BAS), qui se compose d'un fluorophore donneur (cerulean) et un fluorophore accepteur (citrine) qui sont fusionnés avec le récepteur de farnésoïde X (FXR) un domaine de liaison de ligand (FXR LBD) et un peptide contenant un motif LXXLL 8. Ce peptide associe à la FXR LBD d'une manière dépendante de l'acide biliaire. Lors de l'activation de FXR, la distance entre citrine et céruléen va modifier en raison d'un changement de conformation. Dans les lignées cellulaires de mammifères, des résultats d'activation de FXR à une augmentation clairement détectable dans la citrine / rapport céruléen, tandis que le capteur purifiée travaille dans la direction opposée et conduit à un ratio de FRET diminué lors de l'activation de FXR. Ce capteur (CytoBAS)permet la surveillance de la dynamique cytosoliques de l'acide biliaire. Par addition carboxy-terminale de motifs de ciblage subcellulaire, la construction d'BAS peut être ciblé vers le noyau (NucleoBAS) et les peroxysomes (PeroxiBAS), ce qui permet des mesures de concentrations d'acides biliaires dans différents compartiments cellulaires. Bien que l'ajout du motif de ciblage des peroxysomes ne porte pas atteinte à sa réactivité aux acides biliaires, cellules perméables FXR-ligands n'a pas induit de changements de FRET PeroxiBAS intérieur peroxysomes 8. Comme la nature de cette différence est inconnue, le protocole ci-dessous se concentre sur CytoBAS et NucleoBAS.
L'utilisation de ce capteur de FRET codées génétiquement a été récemment démontrée dans des cellules contenant les transporteurs hépatique des acides biliaires Na + polypeptide / taurocholate co-transport (PNT) et de soluté organique transporteur alpha / bêta (8) OSTαβ. NTCP est l'importateur hépatique de l'acide biliaire principale et OSTαβ est une bile intestinale basolatéraletransporteur d'acide qui peuvent fonctionner à la fois comme un importateur et exportateur dépend de la concentration gradient de l'acide biliaire électrochimique 9, 10. Des données récentes ont montré que, lors du transport des acides biliaires par PNAT et / ou OSTαβ, les réponses robustes et rapides dans FRET rapport à la suite de l'interaction ligand-FXR-LBD peuvent être observées.
Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour les méthodes pour mesurer FRET telles que l'analyse microscopique confocale de fluorescence et de tri des cellules activées (FACS), soulignons étapes critiques, résoudre les problèmes potentiels et de discuter des méthodes alternatives. L'utilisation de ce capteur de FRET génétiquement codé, l'interaction de l'acide biliaire avec FXR-LBD peut être quantifié et surveillé directement dans les cellules vivantes et fournit un procédé simple et rapide de visualiser la dynamique et le transport de l'acide biliaire en temps réel. Des plasmides d'expression de mammifères codant pour CytoBAS NucleoBAS et sont disponibles commercialement. Par conséquent, ce biocapteur peut en outre contribuer à lacompréhension des transporteurs d'acides biliaires ou des composés qui activent FXR et fournissent une connaissance plus approfondie de la biologie de l'acide biliaire et de signalisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l'utilisation d'un capteur d'acide biliaire selon l'invention génétiquement codé capable de contrôler la dynamique spatio-temporelles de transport de l'acide biliaire dans des cellules vivantes. Ce biocapteur est constitué de protéines fluorescentes et céruléens citrine qui sont fusionnées à FXR LBD, en formant ainsi un capteur d'acide biliaire à base de FRET (BAS).
Le capteur acides biliaires est relativem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
Referências
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