Élaboration d'un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d'un vecteur viral adéno-associé recombinant
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
Afin d'étudier les voies moléculaires de la maladie de Parkinson (PD) et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, les chercheurs scientifiques reposent sur des modèles animaux. L'identification des gènes PD-associé a conduit à l'élaboration de modèles PD génétiques. La plupart des modèles transgéniques de souris α-SYN développer progressivement la pathologie α-SYN, mais ne parviennent pas à afficher une perte de cellules dopaminergiques claire et des déficits comportementaux dopamine-dépendante. Cet obstacle a été surmonté par le ciblage direct de la substantia nigra avec des vecteurs viraux surexprimant les gènes PD-associés. la livraison de gènes local en utilisant des vecteurs viraux fournit un moyen attrayant pour exprimer des transgènes dans le système nerveux central. Des régions cérébrales spécifiques peuvent être ciblés (par exemple , le locus niger), l' expression peut être induite dans le cadre des adultes et des niveaux d'expression élevés peuvent être atteints. En outre, des systèmes de vecteurs différents en fonction de différents virus peuvent être utilisés. Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer un vecteur virall'injection dans la substance noire de rat pour développer un modèle animal vecteur viral à base d'alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson.
Introduction
Pour étudier la physiopathologie de PD et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il y a un besoin urgent de modèles animaux qui ressemblent étroitement les symptômes neuropathologie, physiologie et moteur de PD humaine. La valeur prédictive plus élevée, mieux nous pouvons traduire de nouvelles thérapies de modèles animaux pour les patients.
La découverte de l'alpha-synucléine (α-SYN) comme premier gène PARK en 1997 a conduit au développement des premiers modèles pharmacodynamiques génétiques. Beaucoup de souris transgéniques surexprimant humain de type sauvage (WT) ou mutant (A30P, A53T) α-SYN ont été générés au cours de la dernière décennie. Les niveaux d'α-SYN surexpression se sont révélés être crucial dans le développement de la pathologie. Aussi la souche de souris, la présence ou l' absence de endogène α-SYN et si la longueur totale ou une forme tronquée est exprimée, joue un rôle (examen détaillé par Magen et Chesselet 1). La surexpression à la fois de type sauvage et des mutants de plusieurs cliniques humains et# 945; SYN chez des souris transgéniques induit l' accumulation pathologique de α-SYN et un dysfonctionnement neuronal 2-6. Cependant, jusqu'à ce que les modèles les plus maintenant transgéniques de souris α-SYN échoué à afficher une perte de cellules dopaminergiques claire et des déficits comportementaux dopamine-dépendante.
Cet obstacle a été surmonté par le ciblage direct de la substantia nigra (SN) avec des vecteurs viraux surexprimant α-SYN. Les vecteurs viraux sont dérivés de virus qui peuvent infecter des cellules facilement, d'introduire du matériel génétique dans leur génome hôte et la force de la cellule hôte de répliquer le génome viral afin de produire de nouvelles particules virales. Les virus peuvent être modifiés pour des vecteurs non répliquants viraux qui conservent leur capacité à pénétrer dans les cellules et introduire des gènes. En supprimant des parties du génome viral et de les remplacer par des gènes d'intérêt, l'application du vecteur résultera en une seule infection ronde sans se répliquer dans la cellule hôte, désigné comme «transduction». vecteurs viraux cun être utilisé pour les deux surexpression et le silençage génique. Le transgène exprimé peut être une protéine rapporteur (par exemple des protéines vert fluorescent ou la luciférase de luciole) 7, une protéine thérapeutique pour des applications de thérapie génique 8-10 ou, comme nous allons nous concentrer dans ce papier, une protéine liée à la maladie utilisé pour la modélisation de la maladie 11 -14.
la livraison de gènes médiée par un vecteur viral constitue un autre moyen d'exprimer des transgènes dans le SNC avec plusieurs avantages. Utilisation de la prestation de transgène locale, des régions cérébrales spécifiques peuvent être ciblés. En outre, l'expression du transgène peut être induite à l'âge adulte pour diminuer le risque de mécanismes de compensation au cours du développement. En outre, les modèles peuvent être créés en différentes espèces et souches. Et enfin, les différents transgènes peuvent facilement être combinés. En utilisant des vecteurs viraux, des niveaux élevés d'expression du transgène peut être atteint, ce qui peut être crucial puisque l'apparition et la gravité de la maladie dépendent souvent du niveau de OVEREXPression.
Plusieurs systèmes de vecteurs à base de virus ont été développés. Le choix du système de vecteur dépend de la taille du gène d'intérêt, la durée requise de l'expression génique, la cellule cible et des problèmes de biosécurité. Pour un transfert de gène stable dans le cerveau, lentivirus (LV) et du virus adéno-associé recombinant (rAAV) des vecteurs sont maintenant considérés comme des systèmes de vecteurs de choix car ils conduisent à une expression de gène efficace et à long terme dans le cerveau des rongeurs. Pour le ciblage spécifique des neurones dopaminergiques (DN) de la SN, vecteurs rAAV ont progressivement surpassés vecteurs LV en raison de leurs titres plus élevés et l'efficacité de transduction de DN.
Les modèles de rongeurs à base meilleures α-SYN actuellement disponibles ont été élaborées à partir d' une approche combinée en utilisant les nouveaux sérotypes d'AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) et optimisé des constructions de vecteur, des titres, et la pureté 15,16. Le titre du vecteur, ainsi que la pureté du vecteur influence directementle résultat phénotypique du modèle. Les titres de vecteur excessifs ou lots de vecteurs insuffisamment purifiés peuvent entraîner une toxicité non spécifique. Par conséquent, les vecteurs de contrôle appropriés sont indispensables. investissement de temps considérable dans la production de vecteur, upscaling, et les procédures de purification virale ont également révélé essentiel pour obtenir des lots de vecteurs reproductibles et de qualité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Le titre du vecteur, ainsi que la pureté du vecteur influence directement le résultat phénotypique du modèle. Les titres de vecteur excessifs ou lots de vecteurs insuffisamment purifiés peuvent entraîner une toxicité non spécifique. Par conséquent, l'utilisation de lots de vecteurs de haute qualité et des vecteurs de contrôle appropriés est indispensable. En outre, le positionnement exact de la tête du rat dans le cadre stéréotaxique et une déterm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Joris Van Asselberghs et Ann Van Santvoort pour leur excellente assistance technique. La recherche a été financée par l'IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), le FWO Vlaanderen (G.0768.10), par le programme CE-FP6 'DiMI' (LSHB-CT-2005-512146), le projet FP7 MEFOPA RTD (SANTÉ -2009 à 241791), le programme FP7 'inmind' (SANTÉ-F2-2011-278850), la KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), et le Fondation MJFox (validation Cible 2010). A. Van der Perren et C. Casteels sont un des boursiers postdoctoraux du Fonds flamand de la recherche scientifique. K. Van Laere est un compagnon clinique principal du Fonds flamand de la recherche scientifique.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
Referências
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