Utvikling av en Alpha-synuclein Based Rat Modell for Parkinsons sykdom via Stereo Injeksjon av en rekombinant adenoassosiert Viral Vector
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
For å studere de molekylære veier av Parkinsons sykdom (PD) og for å utvikle nye terapeutiske strategier, vitenskapelig undersøkere stole på dyremodeller. Identifiseringen av PD-assosierte gener har ført til utvikling av genetiske PD-modeller. De fleste transgene α-SYN musemodeller utvikle gradvis α-SYN patologi, men ikke klarer å vise tydelig dopaminerge celle tap og dopaminavhengige atferds underskudd. Dette hinderet ble overvunnet ved direkte målretting av substantia nigra med virale vektorer overekspresjon PD-assosiert gener. Lokal genavlevering ved hjelp av virale vektorer gir en attraktiv måte å uttrykke transgener i sentralnervesystemet. Bestemte områder av hjernen kan være målrettet (f.eks substantia nigra), kan ekspresjon bli indusert i den voksne omgivelser og høye ekspresjonsnivåer kan oppnås. Videre kan forskjellige vektor-systemer basert på ulike virus anvendes. Protokollen skisserer alle avgjørende skritt for å utføre en viral vektorinjeksjon i substantia nigra fra rotte for å utvikle en viral vektor-baserte alpha-synuclein dyremodell for Parkinsons sykdom.
Introduction
Å studere patofysiologien av PD og for å utvikle nye terapeutiske strategier, er det et stort behov for dyremodeller som tett ligner de nevropatologi, fysiologi og motoriske symptomer på menneskelig PD. Jo høyere prediktiv verdi, jo bedre kan vi oversette nye behandlingsformer fra dyremodeller til pasienter.
Oppdagelsen av alpha-synuclein (α-SYN) som den første PARK genet i 1997 førte til utviklingen av de første genetiske PD-modeller. Mange transgene mus overekspresjon human villtype (WT) eller mutant (A30P, A53T) α-SYN har blitt generert over det siste tiåret. Nivåene av α-SYN overekspresjon har vist seg å være viktig i utviklingen av patologien. Også musestamme, tilstedeværelse eller fravær av endogen α-SYN og hvorvidt den fulle lengde eller en trunkert form uttrykkes, spiller en rolle (detaljert gjennomgang av Magen og Chesselet 1). Overekspresjon av både WT og flere kliniske mutanter av menneskelig &# 945; -SYN i transgene mus induserer patologisk akkumulering av α-SYN og neuronal dysfunksjon 2-6. Men inntil nå har de fleste transgene α-SYN musemodeller ikke klarte å vise klart dopaminerge celle tap og dopaminavhengige atferds underskudd.
Dette hinderet ble overvunnet ved direkte målretting av substantia nigra (SN) med virale vektorer overekspresjon α-SYN. Virale vektorer som er avledet fra virus som lett kan infisere celler, innføre genetisk materiale inn i vertsgenomet og tvinge vertscellen for å gjenskape det virale genomet for å danne nye viruspartikler. Virus kan være konstruert for å ikke reproduserende virale vektorer som beholder sin evne til å gå inn celler og introdusere gener. Ved å slette deler av det virale genom og erstatte dem av gener av interesse, vil anvendelse av vektoren resulterer i en enkelt runde infeksjon uten replikasjon i vertcellen, generelt betegnet som "transduksjon". Virale vektorer cen brukes til både overekspresjon og genet demping. Det uttrykte transgenet kan være en reporter protein (f.eks grønt fluorescerende protein eller ildflue luciferase) 7, et terapeutisk protein for genterapianvendelser 8-10 eller, som vi vil fokusere på i denne artikkelen, en sykdomsrelatert protein som brukes for sykdom modellering 11 -14.
Viral vector-genavlevering gir en alternativ måte å uttrykke transgener i CNS med flere fordeler. Ved hjelp av lokale transgen levering, kan bestemte områder av hjernen være målrettet. Videre kan transgene uttrykk induseres i voksen alder redusere risikoen for kompenserende mekanismer under utvikling. Dessuten kan modellene lages i ulike arter og stammer. Og til slutt, ulike transgener kan lett kombineres. Ved hjelp av virale vektorer, kan transgene høye ekspresjonsnivåer bli oppnådd, noe som kan være avgjørende, fordi sykdomsutbruddet og alvorlighetsgraden ofte avhenge av nivået av overexpression.
Flere vektorsystemer basert på forskjellige virus er blitt utviklet. Valg av vektorsystem avhenger av størrelsen av det aktuelle genet, den ønskede varigheten av genekspresjon, målcellen og biologisk problemer. For stabil genoverføring i hjernen, lentiviral (LV) og rekombinant adeno-assosiert viral (rAAV) vektorer er nå betraktet vektorsystemer valg siden de fører til effektiv og langsiktig genuttrykk i gnager hjernen. For spesifikk målretting av dopaminerge nevroner (DN) av SN, har rAAV vektorer gradvis utkonkurrert LV vektorer på grunn av deres høye titre og transduksjon effektiviteten av DN.
De beste α-SYN basert gnagermodeller som er tilgjengelige har blitt utviklet fra en kombinert tilnærming ved hjelp av nyere AAV serotyper (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) og optimalisert vektorkonstruksjoner, titre og renhet 15,16. Vektoren titer samt vektoren renhet direkte påvirkerden fenotypiske utfallet av modellen. Overdreven vektor titere eller mangelfullt rensede vektor partier kan føre til ikke-spesifikk toksisitet. Derfor egnede kontroll vektorer er uunnværlig. Betydelig investering i viral vektor produksjon, oppskalering og rensemetoder har også vist seg viktig å få reproduserbare og høy kvalitet vektor grupper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige trinnene i protokollen. Vektoren titer samt vektoren renhet direkte påvirker fenotypiske utfallet av modellen. Overdreven vektor titere eller mangelfullt rensede vektor partier kan føre til ikke-spesifikk toksisitet. Derfor er bruken av høykvalitets vektor grupper og egnede kontroll vektorer uunnværlig. Videre er den nøyaktige plassering av rotte hode i den stereotaksisk ramme og nøyaktig bestemmelse av koordinatene vesentlig i målretting substantia nigra. Etter boring av hull i skallen på i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Joris Van Asselberghs og Ann Van Santvoort for deres utmerkede teknisk assistanse. Forskningen ble finansiert av den IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), den FWO Vlaanderen (G.0768.10), av EF-FP6 programmet «Dimi '(LSHB-CT-2005-512146), den FP7 RTD prosjektet MEFOPA (HELSE -2009-241791), den FP7 program 'inmind' (HELSE-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), og MJFox Foundation (Target validering 2010). A. Van der Perren og C. Casteels er en postdoktorer av den flamske Fund of Scientific Research. K. Van Laere er senior klinisk stipendiat av den flamske Fund of Scientific Research.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
Referências
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson’s disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson’s disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson’s disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson’s Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson’s disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
