Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen
Summary
Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.
Abstract
Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass natürliche Killerzellen (NK) in der Lage, die Beseitigung orthotop implantierten Maus GL26 und Ratten-ZNS-1 malignen Gliomen bald nach intrakraniellen Transplantation, wenn die Krebszellen sind mangelhaft in ihrer Expression des β-Galactosid-bindenden Lektin Galectin erbrachten -1 (Gal-1). Neuere Arbeiten zeigt nun, dass eine Population von Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen ist wichtig, diesen Effekt. Zum besseren Verständnis der Mechanismen, durch die NK und myeloide Zellen zusammenwirken, um Gal-1-defizienten Tumorabstoßung verleihen haben wir ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Analyse von Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen (PBMC) entwickelt. Das Verfahren wird hier durch den Vergleich PBMC Infiltration in das Tumormikroumgebung demonstriert gal-1-exprimierenden GL26 Gliome mit denen gemacht über shRNA Zuschlags gal-1-Mangel. Das Protokoll beginnt mit einer Beschreibung, wie Kultur und bereiten GL26 cells zur Impfung in den syngenen C57BL / 6J Maus Gehirn. Er erklärt dann die Schritte in der Isolation und durchflusszytometrische Analyse von Gliom-Infiltration PBMCs aus dem frühen Gehirn Tumor-Mikroumgebung beteiligt. Das Verfahren ist adaptierbar an einer Reihe von in vivo Versuchsanordnungen, in denen zeitliche Daten auf Immuninfiltration in das Gehirn erforderlich. Die Methode ist empfindlich und hoch reproduzierbare, als Gliom-Infiltration PBMCs aus intrakraniellen Tumoren so schnell wie 24 Stunden nach der Tumor-Transplantation mit vom Zeitpunkt abgestimmt Tumoren im gesamten unabhängigen Experimenten beobachtet ähnliche Zellzahlen isoliert werden. Eine einzelne Experimentator kann das Verfahren aus dem Gehirn der Ernte durchzuführen, um zytometrische Analyse von Gliom-infiltrierenden PBMCs fließen in etwa 4-6 Stunden, je nach der Anzahl der zu analysierenden Proben. Alternative Gliom-Modelle und / oder zellspezifischen Nachweis Antikörper können auch an der Experimentatoren Ermessen verwendet werden, um das Eindringen von mehreren anderen immun zu bewertene Zelltypen von Interesse ohne die Notwendigkeit für die Änderung des Gesamtverfahrens.
Introduction
Gliome sind eine Klasse von neuroepithelial Hirntumoren aus transformierten Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Von all den Gliomen, der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Grad IV Gliom oder Glioblastom (GBM), der häufigsten und tödlichen 1. GBM ist hochfeuerfesten dem aktuellen Standard-of-Care, die aus Tumorentfernung in dem Maße möglich, gefolgt von einer Strahlentherapie mit gleichzeitiger und adjuvanter Chemotherapie mit Temozolomid 2 besteht. Diese tödliche Krebserkrankungen führen einen düstere Prognose von nur 15-18 Monaten des Überlebens aus der Zeit der ersten Diagnose mit nur 5% der Patienten überleben die Krankheit nach 5 Jahren 3.
Das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BBB), haben Mangel an professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), und das zuvor nicht identifizierte Vorliegen bona fide lymphatischen Strukturen innerhalb des Gehirns 4 auf den Begriff der GBM als Immun privilegierten geführt. Doch jetzt zahlreiche Studien show dass diese Hirntumoren Tat erzeugen die Rekrutierung von peripheren Immunzellen, die vorwiegend myeloiden Ursprungs sind die Monozyten, Makrophagen und myeloische-Suppressorzellen (MDSC) 5 umfassen. GBM auch Einfluss auf die Aktivität der Gehirnansässigen Mikroglia zu pro-tumorigenen 6,7 geworden. Lymphoide Zellen, wie CD8 + T-Zellen 8 und CD56 + natürlichen Killerzellen 9 sind ebenfalls im Tumor-Mikroumgebung vorhanden, jedoch in viel geringerer Zahl, eine Tatsache angenommen, dass aufgrund immunsuppressive Funktion Gliom abstammenden Faktoren auf Tumor-assoziierte Makrophagen eingeleitet werden ( TAMs) 10. CD4 + T-Zellen sind auch in GBM, aber ein großer Teil dieser Bevölkerung drückt auch CD25 und FoxP3, Hersteller von immunsuppressiven regulatorischen T (T reg) Zellen 11. Die Gesamt immunsuppressiven Zustand der GBM gipfelt in der Förderung der immunologischen Flucht und Tumorprogression 12.
<p class= "jove_content"> Ein besseres Verständnis der Mechanismen der GBM Immunsuppression ist kritisch für die Entwicklung einer wirksamen immun Strategien entwickelt, um das Immunsystem gegen den Tumor stimulieren. Im Laufe der letzten 15 Jahren unser Labor gearbeitet hat, um die Mechanismen der Gehirntumor immunosuppresson um wirksame neue Anti-GBM-Immuntherapeutika 13-19 Entwicklung zu überwinden. Der Höhepunkt dieser Arbeit wurde nun auf einer klinischen Studie konzipiert, um eine kombinierte zytotoxische und immunstimulatorischen Therapeutikum für Patienten mit neu diagnostiziertem GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov Identifier) zu bewerten geführt.Unsere jüngste Arbeit zeigt, dass Maus GL26 und Ratten CNS-1 GBM Zellen blockieren Anti-Tumor-NK-Zell-Immunüberwachung durch die Produktion großer Mengen des β-Galactosid-bindenden Lektin Galectin-1 (Gal-1) 20. Dies wurde durch die Unterdrückung der Expression von gal-1 in Gliomzellen mit shRNA-vermittelte Gen-Knockdown demonstriert. In vitro experiments zeigte, dass gal-1-defizienten Gliomzellen normalerweise in Kultur vermehrt, noch eine rasante Ablehnung bald nach intrakraniellen Verpflanzung in syngene C57BL / 6J oder RAG1 – / – Mäuse und schafft so die Unabhängigkeit der T- oder B-Zellen, die auf diese Form der Tumorabstoßung. NK-Zellen Immunodepletion mit anti-Asialo-GM 1-Antiserum oder monoklonalen Antikörpern NK1.1 führte zur vollständigen Wiederherstellung von intrakraniellen gal-1-defizienten Gliom Wachstum, zur Gründung der Rolle von NK-Zellen in gal-1-defizienten Gliom Ablehnung. Wir zeigen nun, dass die Immundepletion der Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen ausreichend ist, um Gal-1-defizienten Gliom Ablehnung trotz der Anwesenheit von NK-Zellen zu verhindern, offenbart somit ein unverzichtbares Hilfsrolle für myeloide Zellen in den gleichsinnigen von NK-vermittelte gal -1-defizienten Tumor Lyse (unveröffentlichte Daten). Dieses unerwartete Ergebnis hat uns dazu geführt, eine umfassende Protokoll für die Isolierung und Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu entwickeln,infiltrieren das Gehirn Tumor-Mikroumgebung bald nach intrakraniellen engraftment damit wir bessere Charakterisierung der Immuninfiltration Ereignisse, die gal-1-defizienten Gliom Ablehnung Prädikat.
Das Verfahren wird hier durch die Verwendung der Maus GL26 Gliom-Zellen, die konstitutiv exprimieren mCitrine fluoreszierendes Protein, genannt GL26-Cit, die direkte Tumorzellvisualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie 21 erlauben demonstriert. Diese Zellen werden stereotaktisch in das Gehirn eines syngenen C57BL / 6J-Mäusen eingeimpft und für 24, 48 oder 72 Stunden vor der Euthanasie Maus wachsen. Gliom-Infiltration PBMCs werden dann isoliert und immun mit Anti -CD45, -GR-1, -CD11b und -NK1.1 Zelloberflächenantikörper zusammen mit intrazelluläre Immunmarkierung für Granzym B (GzmB). Diese spezielle Kombination von Antikörpern erlaubt die Identifizierung von Tumor-infiltrierenden Gr-1 + / CD11b + myeloiden Zellen und NK1.1 +, NK-Zellen, Zelltypen wir been verwickelt in gal-1-defizienten Tumorabstoßung. Die Immuninfiltration Profil gal-1-defizienten GL26-Cit Gliom, hier bezeichnet als GL26-Cit-gal1i, wird dann zu der Gliome exprimieren ein normales Niveau von Gal-1 genannt GL26-Cit-NT, die ein nicht enthalten im Vergleich Targeting Steuer shRNA Haarnadel. Das Protokoll beginnt mit einer Beschreibung, wie man Kultur GL26-Cit-Gliomzellen in vitro, die durch eine Erklärung, wie orthotop engraft diese Zellen in das Striatum von syngenen C57BL / 6J Mäusen folgt. Es geht dann zu den Schritten bei der Isolierung und Immunmarkierung von Gliom-Infiltration PBMCs für durchflusszytometrische Analyse beteiligt aufzuzählen. Das Protokoll schließt mit einer Erläuterung von Standarddatenanalyse und grafische Darstellung.
Die Demonstration zeigt, dass sowohl Gr-1 + / CD11b + myeloischen Zellen und NK1.1 + NK-Zellen bevorzugt im gal-1-defizienten Gehirn Tumor-Mikroumgebung innerhalb von 48 akkumulierenhr der Tumorimplantation, ein Ergebnis, das zu erklären, warum diese Tumoren schnell komplette Tumorlyse ca. 1 Woche nach der Tumor-Transplantation unterziehen 20 hilft. Das Verfahren ist leicht an einer Reihe von in vivo verschiedenen experimentellen Designs, in welchem zeitlichen Daten auf Immuninfiltration in das Gehirn erforderlich. Eine einzelne Experimentator kann das Protokoll von Gehirn Ernte durchzuführen, um zytometrische Analyse von Gliom-infiltrierenden PBMCs fließen in etwa 4-6 Stunden, je nach der Anzahl der zu analysierenden Proben. Das Verfahren kann auch mit Experimenten gerichtet, um das Profil des zirkulierenden PBMCs in tumortragenden Mäuse für einen Vergleich mit denen, die das Gehirn infiltrieren so Immunsuppression Phänotypen speziell von der Tumor-Mikroumgebung induziert identifizieren charakterisieren kombiniert werden. Anwendung dieser und ähnlicher Verfahren sollte ein besseres Verständnis der Faktoren, die in den Handel mit peripheren Immunzellen in das Gehirn Tumor-Mikroumgebung beteiligt sind, erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse PBMCs, die die frühe Mausgehirn-Tumor-Mikroumgebung infiltriert haben. Gliom Zellsuspensionen werden in einem vom Experimentator, die stereotaktisch in das Striatum des Gehirns der Maus eingepflanzt werden festgelegte Wert generiert. Mäuse werden dann in vorgegebenen von der Versuchsplanung festgelegten Zeitpunkten getötet und ihre Gehirne werden geerntet und verarbeitet, um Gliom-Infiltration PBMCs, di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health / Nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NIH / NINDS) gewährt R01-NS074387, R01-NS057711 und R21-NS091555 zu MGC unterstützt; NIH / NINDS gewährt R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 und R21-NS084275 zu PRL; Zuschüsse aus Leas Happy Hearts, University of Michigan Comprehensive Cancer Center an MGC und PRL vergeben; die Klinik für Neurochirurgie, Universität von Michigan School of Medicine; der Michigan-Institut für klinische und Gesundheitsforschung, die von NIH Zuschusses 2UL1-TR000433 unterstützt; die Universität von Michigan Cancer Biology Ausbildungsbeihilfe von NIH / NCI (National Cancer Institute) Zuschuss T32-CA009676 unterstützt; die Universität von Michigan Ausbildung in klinischer und Grundneuroscience von NIH / NINDS unterstützt gewähren T32-NS007222; und der University of Michigan Medical Scientist Training Program von NIH / NIGMS (Nationales Institut für Allgemeinmedizin Wissenschaften) unterstützt gewähren T32-GM007863. Die Autoren einre dankbar für die akademische Führung und Unterstützung von Dr. Karin Muraszko und der Klinik für Neurochirurgie erhalten; M. Dahlgren, D. TOMFORD und S. neapolitanischen für hervorragende administrative Unterstützung; M. Dzaman für herausragende technische Hilfe; und Phil F. Jenkins für die großzügige Unterstützung für den Kauf eines Zeiss 3D Scanning Electron Microscope. Wir erkennen auch die Kuchroo Labor an der Harvard Medical School, von dem eine modifizierte Version des Dichtezentrifugation Medien vermittelte Strategie für die Isolierung von Gehirnmononuklearen Zellen gezogen wurde.
Materials
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
| 0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
| 1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
Referências
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