Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Les cellules cultivées dans les CPF voient aucune modification des concentrations d'oxygène ou de dioxyde de carbone qui se déplacent d'incubateur pour chambre de traitement au microscope la chambre et le dos. Il est essentiel que les conditions dans chacune des chambres sont adaptées à l'incubateur particulier dans lequel les cellules sont maintenues avant que les cellules sont retirées de l'incubateur. L'atmosphère à l'intérieur de l'appareil est continuellement filtré HEPA et peut être adaptée en ce qui concerne les concentrations d'oxygène et de dioxyde de carbone. Les cellules peuvent être cultivées à des concentrations standard pour PSCs ou NNC, 5% et 9%, respectivement; ou des concentrations différentes peuvent être choisies pour différents types de cellules ou pour des expériences spécifiques. Ainsi, l'appareil est alimenté par des sources constantes d'oxygène de qualité médicale, le dioxyde de carbone et de l' azote (figure 4). Tous les trois de ces gaz sont alimentés par des systèmes multiples spécifiques à gaz qui assurent un approvisionnement constant. L'appareil est également alimenté par un mélange de gaz d'étalonnage constitué par10% (± 0,01%), du dioxyde de carbone en oxygène. Les systèmes multiples sont logés à l'extérieur du centre de production de cellules et les gaz sont acheminés dans l'installation à travers le plafond. Le gaz d'étalonnage est logé dans l'établissement. L'appareil est en outre fourni avec un vide, aussi à travers le plafond. L'utilisation d'un système de surveillance électronique et sans fil unités d'envoi, les pressions de sortie de tous les collecteurs sont constamment surveillés. Dans le cas où aucune pression tombe hors de portée, les exploitants d'installations de production de cellules sont automatiquement téléphonaient et notifiées telles que des mesures appropriées peuvent être prises.
Les exigences de puissance de l'appareil sont remplies par six dédiés 120 V circuits descendant du plafond et connectés aux générateurs de secours de l'hôpital pour assurer un approvisionnement constant. Le fonctionnement du dispositif est contrôlé par le logiciel sur un ordinateur basé sur PC alimenté par une alimentation de secours. Ces arrangements d'alimentation électrique et de l'informatiqueveiller à ce que le système fonctionne en continu même en cas de défaillance du système d'alimentation public. Le logiciel de commande de l'appareil dispose d' une interface graphique conviviale (figure 1) qui permet le contrôle des concentrations en oxygène et en dioxyde de carbone, ainsi que les pressions de température, d' humidité et de la chambre. Les valeurs de tous ces paramètres sont enregistrés en continu pour fournir un enregistrement en cours d'exécution de tous les paramètres de l'appareil. Ces données sont sauvegardées sur un serveur distant chaque nuit pour protéger leur intégrité. L'ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance par les utilisateurs administratifs pour évaluer et / ou modifier tout paramètre. En outre, l'ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance, ce qui permet une évaluation interactive des paramètres de l'appareil et le dépannage des utilisateurs locaux. Une alarme unité d'envoi supplémentaire est connecté à l'appareil de telle sorte que les exploitants d'installations de production de cellules sont informés de toute condition hors de portée de l'appareil. L'accès à distance capacités permettent de vous connecter et évaluation des spécificités de la condition hors de portée.
L'appareil est réalisé sous la forme d'un système modulaire, aussi bien dans une macro et micro-sens. Les modules de culture de cellules individuelles, telles que des incubateurs et des chambres de traitement, peuvent être adaptés en ce qui concerne leurs dimensions et des exigences, ainsi que dans leur disposition par rapport à l'autre. En outre, la plupart des fonctions de contrôle des modules individuels sont eux-mêmes modulaires tels que les différents contrôleurs de gaz atmosphériques, par exemple, peuvent être facilement remplacés sans interruption importante du système.
des chambres de traitement spécialisées, comme une pour la visualisation et la manipulation des cultures de cellules microscopiques, sont facilement adaptés au système. Deux contraste de phase et un microscope de fluorescence sont à l' intérieur du système (figure 6) de sorte que les cellules peuvent être colorées en direct, et les colonies peuvent être disséqués dans les mêmes conditions atmosphériques à l' intérieur de til incubateurs. Acheminement des câbles à travers des oeillets scellés dans les parois latérales de la chambre de traitement permet des équipements tels que des alimentations et des ordinateurs pour être gardés à l' extérieur de l'appareil, le plus souvent sur un chariot (figure 6).
Les chambres de traitement dans l'installation de production de cellules ont un modèle de flux d'air différent de GCS classiques. Dans les GCS classiques, le flux d'air circule vers le bas à partir d'un évent d'échappement central et se divise en deux courants séparés qui sont ensuite repris par deux orifices d'entrée différents dans la partie avant et arrière du plancher de l'armoire. En revanche, le PCF a un seul évent dans la partie avant du plafond. L'air circule vers le bas et vers l'arrière de la chambre, où il est ensuite tiré vers le haut dans un conduit d'admission. Bien que le PCF est intrinsèquement très propre, ce modèle de flux d'air unique signifie que les techniciens doivent ajuster légèrement leur technique afin de réduire le risque de contamination. Comme avec un BSC classique, un laboratoire travailleur should éviter de placer leurs mains ouvertes en amont des plaques de culture cellulaire et des bouteilles de médias. Cependant, la direction qui est en amont a été modifié dans le CPF
Le laboratoire de l'installation de production de cellule elle-même est assez standard et est équipé d'un -20 ° C congélateur, -80 ° C congélateur, un réfrigérateur C 4 °, une centrifugeuse et un bain d'eau. Le laboratoire dispose également d'un évier avec des commandes de pied pour une utilisation mains-libres pratique. Pour ce laboratoire pour devenir une installation clinique fonctionnelle de production de cellules, cependant, plusieurs modifications supplémentaires doivent encore être apportées. Tout d'abord, l'appareil lui-même doit être mis à niveau pour avoir la capacité de surveiller les composés organiques volatils, les particules et les concentrations de dioxyde de chlore qui est utilisé pour la décontamination. D'autre part, une chambre de traitement contenant une machine FACS peut être logé et connecté au reste de l'appareil par l'intermédiaire d'un module de mémoire tampon. Cela permettra de triage des cellules et la purification de trpopulations de cellules ansplantable dans les conditions environnementales appropriées. Enfin, l'ensemble de l'appareil doit être installé dans un mur souple chambre propre. Ceci fournit une Organisation internationale de normalisation (ISO) classe 8 environnement pour l'appareil 5.
La stérilité élevée et la nature contrôlé par ordinateur du PCF en fait un système idéal pour les applications futures avec la thérapie et de bons procédés de fabrication à base de cellules. Le risque de contamination est considérablement atténué, mais plus important encore, les conditions de l'expansion des cellules sont automatiquement enregistrées et archivées par le système informatique. Déviations des concentrations de gaz, la température, l'humidité et tous les événements d'accès dans le système sont rigoureusement documentés. Cela peut grandement aider lors d'enquêtes sur des problèmes de qualité du produit. Cependant, il y a encore des limites. L'utilisation de tout et de tous les réactifs et les fournitures (par exemple, les composants de médias, pipettes, plaques) doit être documenté séparément. Ajouteritionally, il existe une multitude de problèmes potentiels (y compris de nombreuses formes de l'erreur humaine) qui peuvent survenir, qui sont sans aucun rapport avec les variables documentées par le système de surveillance de la CPF. Ainsi, la nécessité d'un personnel hautement qualifié et la documentation manuelle détaillée des tâches reste en place.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le personnel de Biospherix pour leur aide à apprendre à utiliser le système de culture cellulaire XVIVO clos, en particulier Matt Freeman; le personnel de Miles & Kelley Construction Company, Inc. pour leur travail dans la mise en place de l'infrastructure de laboratoire, en particulier Russ Hughes; le personnel de l'Hôpital pour enfants du département Orange County des installations et des services de soutien pour leur travail dans la coordination de la rénovation de laboratoire, en particulier Adam Lukhard et Devin Hugie; le personnel de l'Hôpital pour enfants du département Orange County des systèmes d'information pour leur aide dans la mise en place de l'infrastructure de gestion des données et l'accès à distance, en particulier Viet Tran; Hôpital du comté d'Orange équipe de direction de l'enfance pour leur soutien de longue date du projet, en particulier le Dr Maria Minon et Brent Dethlefs. Ce travail a été financé par l'Hôpital pour enfants du comté d'Orange et du California Institute for Regenerative Medicine par subvention TR3-05476 à PHS. Tous les auteurs ont contribué également à ce travail.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |