मानव जमे हुए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल नमूनों से सीडी 90+ तंतुकोशिका / पेशीतंतुकोशिकाएं का अलगाव
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblasts / myofibroblasts (एमएफ) रोगजनन में उनकी भूमिका और ट्यूमर microenvironment के दोनों घाव भरने और संवर्धन के लिए उनके योगदान के लिए बढ़ती ध्यान प्राप्त किया गया है। वर्तमान में जठरांत्र (सैनिक) ऊतकों से म्यूचुअल फंड के अलगाव के लिए कई तकनीकों हैं, वहीं इस प्रोटोकॉल जमे हुए ऊतकों से इन stromal कोशिकाओं के अलगाव के एक उपन्यास तत्व का परिचय। सैनिक ऊतक नमूनों बर्फ़ीली न केवल दुनिया भर में सहयोगियों, biobanks, और वाणिज्यिक विक्रेताओं से नमूने प्राप्त करने के लिए शोधकर्ता यह भी ताजा नमूनों की देरी प्रसंस्करण परमिट की अनुमति देता है। वर्णित प्रोटोकॉल लगातार मार्कर CD90, α-SMA और vimentin कि एक्सप्रेस एमएफ phenotype के साथ विशेषता धुरी के आकार की कोशिकाओं निकलेगा। इन कोशिकाओं को रोगी के नमूनों से प्राप्त कर रहे हैं के रूप में, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग भी रोग राज्यों-अर्थात् कैंसर और सूजन आंत्र रोग से बारीकी से नकल उतार मुचुअल फंड का लाभ प्रदान करता है। इस तकनीक को मधुमक्खी हैएन आमाशय, छोटी आंत, और colonic एमएफ प्राथमिक संस्कृति पीढ़ी में मान्यता प्रदान की। प्राथमिक एमएफ संस्कृतियों पारित होने के एक नंबर पर प्रयोगों की एक विशाल सरणी में इस्तेमाल किया जा सकता है और उनकी पवित्रता दोनों immunocytochemistry के द्वारा मूल्यांकन और विश्लेषण के प्रवाह cytometry।
Introduction
पेशीतंतुकोशिकाएं / fibroblasts (एमएफ) जठरांत्र (सैनिक) म्यूकोसा में कोशिकाओं की एक प्रचुर मात्रा में आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये stromal कोशिकाओं सिर्फ उपकला के नीचे स्थित है और पेट में श्लैष्मिक पटल Propria भीतर एक परस्पर नेटवर्क के रूप में कर रहे हैं। म्यूचुअल नहीं बाह्य मैट्रिक्स के बयान के लिए ही जिम्मेदार हैं, लेकिन पैराक्राइन विनियमन के माध्यम से सटे उपकला 1, 2 की इलेक्ट्रोलाइट परिवहन, क्षतिपूर्ति, और बाधा समारोह को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, म्यूचुअल सूजन और ऊतकों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है 3, 4 remodeling। पेशीतंतुकोशिकाएं वे भी कैंसर से जुड़े fibroblasts के रूप में जाना जाता है जहां ट्यूमर microenvironment, का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं, और ट्यूमर कोशिकाओं के विकास में योगदान और कैंसर स्टेम कोशिकाओं 3 के लिए एक जगह के रूप में सेवा करते हैं। उभरते डेटा म्यूचुअल फंड के रूप में भी स्थानीय प्रतिजन कोशिकाओं सेवा कर सकते हैं कि पता चलता है। इसके अतिरिक्त, म्यूचुअल समारोह सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में महत्वपूर्ण नियामकों, उत्पादों होगासाइटोकिन्स और वृद्धि कारकों 5 की एक किस्म cing।
स्वस्थ व्यक्तियों में, म्यूचुअल कोशिकाओं इन कोशिकाओं को भी vimentin के लिए सकारात्मक रहे हैं। Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से अलग है और उनके कोशिका की सतह, mesenchymal मार्कर, CD90 3, 5 पर व्यक्त करने के लिए माना जाता है, लेकिन उपकला और hematopoietic सेल मार्कर, EpCAM और CD45 के लिए नकारात्मक , क्रमशः। पेशीतंतुकोशिकाएं fibroblasts की एक सक्रिय रूप हो सुझाव दिया है और α-एसएमए 5 की अभिव्यक्ति द्वारा गैर सक्रिय fibroblasts से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।
पिछले एक दशक के दौरान, मानव colonic म्यूकोसा से पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव के लिए एकाधिक दृष्टिकोण प्रकाशित-ज्यादातर मूल रूप महीदा एट अल। 5-8 से वर्णित विधि के आधार पर की गई है। व्यक्तिगत अध्ययनों विभिन्न पेट म्यूकोसा, कई सैनिक पथ के क्षेत्रों (यानी, गैस्ट्रिक, छोटे और एल से म्यूचुअल फंड के अलगाव के लिए कोई सार्वभौमिक प्रोटोकॉल से अलगाव प्रक्रियाओं की रिपोर्ट जबकिARGE आंत्र mucosa) प्रकाशित किया गया है। इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का परीक्षण किया है और सफलतापूर्वक ऊपर उल्लेख ऊतक के सभी तीन प्रकार के लिए इस्तेमाल किया गया है। । इसके अलावा, जमे हुए सैनिक म्यूकोसा से म्यूचुअल फंड को अलग-थलग करने के लिए प्रक्रियाओं की सूचना नहीं किया गया है।
यहाँ, हम enzymatic पाचन पर आधारित है, जो एक अनुकूलित विधि, वर्तमान और समवर्ती संस्कृति के लिए मानव आंत श्लैष्मिक म्यूचुअल फंड के अलगाव के लिए अनुमति देता है और हौसले से पचा, एकल कोशिका, श्लैष्मिक तैयारी में प्रवाह cytometry विश्लेषण। इस तकनीक को मज़बूती से एक एमएफ phenotype के साथ प्राथमिक संस्कृतियों पैदावार। इसके अलावा, एक ही तरीके के रूप में अच्छी तरह से आमाशय और छोटी आंतों के ऊतकों के जमे हुए नमूनों से म्यूचुअल फंड को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ताजा सैनिक ऊतक से पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव पहले से वर्णित किया गया है; हालांकि, जमे हुए नमूनों के उपयोग के कई लाभ प्रस्तुत करता है। अर्थात्, शोधकर्ताओं capabi है, जो दुनिया भर में सहयोगियों के किसी भी नंबर से इकट्ठा करने और दुकान के ऊतकों करने में सक्षम होगाlity जमे हुए ऊतकों के नमूनों जहाज करने के लिए। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने अपने वर्तमान प्रयोग अनुसूची के साथ संघर्ष करने के अलगाव के लिए ऊतक प्रसंस्करण ऑपरेटिंग कमरे और / या एंडोस्कोपी सूट और तत्काल से खारिज कर दिया ऊतक का संग्रह मिल सकता है। इसके अलावा, सर्जरी की अप्रत्याशित प्रकृति के कारण, ऊतक खरीद प्रसंस्करण ऊतक के लिए छोड़ दिया है समय सीमित कर देगा, जो बहुत देर से दिन में हो सकती है। बाद में प्रसंस्करण के लिए ऊतक ठंड इन चुनौतियों उन्नति होगी।
अन्त में, इन तरीकों में सफलतापूर्वक ऐसी कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और सूजन आंत्र रोग के रूप में रोग राज्यों में, colonic आमाशय और छोटी आंतों पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव में उपयोग किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक संभावित कैंसर शकुन बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में stromal कोशिकाओं के महत्वपूर्ण बढ़ते महत्व के प्रकाश में, केवल अनुसंधान आवेदन के लिए विकसित किया गया था, वहीं बाद में उपयोग के ल…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
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