Isolering av CD 90+ Fibroblast / myofibroblasts fra Menneskerettighets Frosne Gastrointestinale Prøver

Summary

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Abstract

Fibroblaster / myofibroblasts (MFS) har vært å få økt oppmerksomhet for sin rolle i patogenesen og deres bidrag til både sårheling og promotering av svulsten mikromiljøet. Mens det i dag flere teknikker for isolering av MFS gastrointestinale (GI) vev, innfører denne protokollen et nytt element i isolering av disse stromale celler fra frosset vev. Frysing GI vevsprøver ikke bare tillater forskeren å skaffe prøver fra hele verden kollaboratører, biobanker, og kommersielle leverandører, også tillater det forsinket behandlingen av ferske prøver. Den beskrevne protokollen konsekvent vil gi karakteristiske spindelformede celler med MF fenotype som uttrykker markørene CD90, α-SMA og vimentin. Når disse cellene er avledet fra pasientprøver, bruk av primære celler gir også fordelen av nært etterligner MFS av sykdomstilstander, nemlig cancer og inflammatoriske tarmsykdommer. Denne teknikken har been validert i mage, tynntarm, og colonic MF primære kultur generasjon. Primære kulturer MF kan brukes i en lang rekke forsøk i løpet av en del av passasjen, og deres renhet bestemt ved både immunocytokjemi og strømningscytometri-analyse.

Introduction

Myofibroblasts / fibroblaster (MFS) representerer et rikt populasjon av celler i gastrointestinal (GI) slimhinnen. Disse stromale celler er plassert like under epitel og danner et sammenkoplet nettverk innen mucosal lamina propria i tarmen. MFS er ikke bare ansvarlig for avsetning av den ekstracellulære matrise, men gjennom parakrine regulering kan påvirke elektro transport, restitusjon, og barrierefunksjon av tilstøtende epitel ^{1, 2.} Videre har MFS vist seg å spille en nøkkelrolle i betennelse og vev remodeling ^{3, 4.} myofibroblasts er en kritisk del av svulsten mikromiljøet, hvor de er også kjent som kreft-assosiert fibroblaster, og bidra til at tumorcellevekst, og tjene som en nisje for kreft stamceller ^3. Emerging data antyder at MFS kan også fungere som lokale antigenpresenterende celler. I tillegg MFS funksjon som viktige regulatorer av medfødte og ervervede immunresponser, procing et utvalg av cytokiner og vekstfaktorer ^5.

Hos friske individer, er MFS celler antas å skille fra stamceller og uttrykker på sin celle overflaten, mesenchymale markør, CD90 ^{3, 5.} Disse cellene er også positivt for vimentin, men negativt for epitel og blodkreft cellemarkør, EpCAM og CD45 hhv. Myofibroblasts er foreslått å være en aktivert form av fibroblaster, og kan skilles fra ikke-aktiverte fibroblaster ved ekspresjon av ^α-SMA-5.

I løpet av det siste tiåret, flere tilnærminger for isolering av myofibroblasts fra menneskelige colonic slimhinnene er publisert-hovedsakelig basert på metoden opprinnelig beskrevet av Mahida et al. ^5-8. Mens individuelle studier rapporterer isoleringsprosedyrer fra forskjellige tarmslimhinnen, ikke universell protokoll for isolering av MFS fra flere områder av mage-tarmkanalen (dvs. mage, liten og large tarmslimhinnen) har blitt publisert. Protokollen som presenteres her er testet og med hell anvendt for alle tre typer vev som er nevnt ovenfor. . Videre prosedyrer for å isolere MFS fra frosne GI slimhinnen har ikke blitt rapportert.

Her presenterer vi en optimalisert metode, som er basert på enzymatisk fordøyelse, og samtidig gjør det mulig for isolering av humane tarmslimhinne MFS for kultur og strømningscytometri-analyse i fersk-fordøyd, encellede, slimhinne preparater. Denne teknikken pålitelig gir primærkulturer med en MF fenotype. Videre kan de samme metoder benyttes for å isolere MFS fra frosne prøver av mage og tynntarms vev i tillegg. Isolering av myofibroblasts fra friskt vev GI er tidligere beskrevet; Men utnyttelsen av frosne prøver presenterer mange fordeler. Nemlig, vil forskerne kunne samle inn og lagre vev fra en rekke samarbeidspartnere over hele verden som har capabiheten til å sende frosne vevsprøver. Videre kan forskerne finne innsamling av kasserte vev fra operasjonsstuen og / eller endoskopi suite og umiddelbar behandling av vev for isolering til konflikt med sin nåværende eksperimentering tidsplan. Også, på grunn av uforutsigbare natur kirurgi, kan vev anskaffelser forekomme svært sent på dagen, noe som vil begrense tid igjen til behandling vev. Frysing vev for senere behandling vil lindre disse utfordringene.

Til slutt, har disse fremgangsmåter blitt anvendt i isoleringen av kolon, mage og tynntarms myofibroblasts i sykdomstilstander så som kolorektal karsinom og inflammatoriske tarmsykdommer.

Protocol

Protokollen for å få forkastet menneskelig vev fra kirurgiske pasienter og etablering av primærkulturer ble godkjent av University of Texas Medical Branch og University of New Mexico Institutional Review Boards. De generelle krav til innkjøp av menneskelige vevsprøver er beskrevet nedenfor. Merk at siden MFS kan isoleres fra frosset vev, biobanker og kommersielle leverandører er også levedyktige alternativer. 1. Få menneskelig vev Send en protokoll for å oppnå menneskeli…

Representative Results

Ved hjelp av denne enzymatisk fordøyelse protokollen, vi har gjennomgående vært i stand til å isolere og dyrke MF populasjon tarm CD90 + slimhinne stromale celler fra GI kirurgiske prøver og biopsier (figur 1). Synlig MF koloni spredning kunne observeres på dag 2 – 5 etter seeding mononukleære cellesuspensjoner inn i 6 brønners plater (Figur 1A-B). MF primærkulturer nå ~ 50 – 70% samløpet av dagen 7. – 11. (figur 1C-D).</str…

Discussion

Mens denne protokollen ble utviklet for forskning programmet kun i lys av økende kritiske viktigheten av stromale celler som et potensielt kreft prognostiske biomarkører og terapeutisk mål, evne til å fryse "funksjonelle" biospecimens for senere bruk gir en betydelig fordel. Dette representerer en unik fordel for etablering av klinisk biorepository, som kan tjene som ekstra verktøy som tjener til å fremme utviklingen av personlig medisin ^{10, 11.} I likhet med funn tidligere rapportert for adipo…

Materials

MEM, 1X	Corning	MT-10-010-CV
Hanks' Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H6648
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062
Ciprofloxacin HCl	Corning	61-277-RF
L-Glutamine, 100x	Corning	25-005-CI
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-CI
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma-Aldrich	646563
0.5M EDTA, pH 8.0	Cellgro	46-034-CI
DNAse	Worthington	LS002139
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I	Sigma-Aldrich	C1639
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II	Sigma-Aldrich	C1764
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Accumax cell dissociation solution	Sigma-Aldrich	A7089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Cell Strainer (70µm)	Corning	352350
PE Mouse Anti-Human Vimentin	BD Biosciences	562337	Clone RV202
FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma-Aldrich	F3777	Clone 1A4
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	559869	Clone 5E10