Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Övervakning leddjur rörelse krävs ofta för att bättre förstå tillhörande populationsdynamik, spridningsmönster, värdväxtpreferenser och andra ekologiska samspel. Leddjur vanligtvis spåras i naturen genom att märka dem med en unik märke och sedan åter samla in dem över tid och rum för att bestämma deras spridningsförmåga. Förutom faktiska fysiska taggar, såsom färgade damm eller färg, har olika typer av proteiner visat sig vara mycket effektiv för märkning leddjur för ekologisk forskning. Proteiner kan administreras internt och / eller externt. Proteinerna kan sedan detekteras på recaptured leddjur med en proteinspecifik enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Här beskriver vi protokoll för externt och internt märkning leddjur med protein. Två enkla experimentella exempel demonstreras: (1) ett inre proteinmärke presenterad för en insekt genom att tillhandahålla en proteinberikade diet och (2) en yttre proteinmärke topiskt enpplied till en insekt med hjälp av en medicinsk nebulisator. Vi relaterar sedan en steg-för-steg guide för smörgås och indirekta ELISA metoder som används för att detektera protein märken på insekterna. I denna demonstration, är olika aspekter av förvärv och detektion av proteinmarkörer på leddjur för märke-release-återfångst, mark-capture, och själv pålägg fånga typer av forskning diskuteras, tillsammans med de olika sätt som immunomarking förfarandet har varit anpassas till ett brett utbud av forskningsmålen.
Förflyttningar av leddjur skadedjur, naturliga fiender (parasitoider och rovdjur), och pollinatörer i naturen är en förutsättning för att bättre förstå hur man kan förbättra ekosystemtjänster. Nyckelkomponenten för de flesta typer av spridnings forskning är att ha en tillförlitlig metod för att märka leddjur (er) av intresse. En mängd olika material (t.ex. färger, färgämnen, färgade damm, taggar, sällsynta element, proteiner) har använts för att markera leddjur att bedöma deras populationsdynamik, spridningsfunktioner, utfodring beteenden och andra ekologiska interaktioner 1,2.
Lämpligheten i en markör som används för en viss spridning forskning kommer att vara beroende av vilken typ av studie genomförs. Det finns tre breda kategoriseringar för märkning leddjur: (1) märke-release-recapture (MRR), (2) mark-capture, och (3) själv mark-capture. För mark-frisättnings återta forskning, markerar utredaren vanligtvis leddjur kollektivt i laboratory och släpper dem på en central plats i fältet. De leddjur sedan återerövras vid olika rumsliga och tidsintervaller med olika strömavtagare (t.ex. svep netto, vakuum, klibbig fälla) 3,4,5. De återerövrades exemplar undersöks sedan för den specifika märket skilja frisläppta från infödda individer. För mark-capture forskning, utredaren gäller vanligtvis märket direkt på fältet med hjälp sprututrustning (t.ex. ryggsäck spruta, bom och munstycke spruta). De bästa markörer för mark-capture forskning är billigt och lätt appliceras på leddjur livsmiljö. För själv mark-capture forskning, utredaren gäller vanligtvis märken till ett leddjur bete 6,7 eller häckar entré 8. I sin tur, markerar leddjur själva internt genom att sluka det markerade bete eller externt med "borsta" upp mot märket som den lämnar boet.
Såsom nämnts ovan, har många typer av markörer varit ossed att märka en mängd olika leddjursarter. Men mycket få är användbara för alla tre av dessa spridningsforskningskategorier. Utvecklingen av proteinet immunomarking förfarandet var ett stort genombrott för märkning insekter. Immunomarking sätter en proteinetikett på leddjur antingen internt eller externt, som i sin tur detekteras av en anti-proteinspecifik enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Den första proteinmarkörer som användes var kaninimmunoglobulin (IgG) och kyckling IgG / IgY 9,10. De har visat sig vara mycket effektiva poäng för MRR och själv mark-capture forskning (se diskussion). Tyvärr, IgG / IgY-proteiner är dyra och är därför inte praktiskt för mark-capture forskning och de flesta typer av själv mark-capture forskning. Därefter har andra generationens protein upptäckt ELISA utvecklad för proteiner i kyckling äggvitor (albumin), komjölk (kasein) och sojamjölk (trypsininhibitor protein). Varje analys är mycket känslig, specifik, och, mestviktigare, använder proteiner som är mycket billigare än de IgG / IgY-proteiner 11. Dessa proteiner har visat sig vara effektiva för MRR, markera-capture, och själv mark-capture forskning (se diskussion).
I den här artikeln, vi beskriver och demonstrerar hur man genomför protein markera laboratorie behålla studier. Sådana studier är den första fasen av forskning som krävs för alla typer av fält spridning studien. Närmare bestämt är det viktigt att utredarna vet hur länge märket kommer att behållas på de riktade leddjursarter innan inleder fältspridningsstudier. Här beskriver vi och visa hur man internt och externt markera insekter för MRR, pålägg capture, och själv pålägg Program fältstudier. Vi visar sedan hur man upptäcker närvaron av varumärken med indirekta och sandwich-ELISA.
Den leddjur protein immunomarking förfarande beskrevs först nästan ett kvarts sekel sedan 9. Sedan dess har det förfarande som anpassats för att studera spridningsmönster ett brett utbud av leddjur som använder både internt och externt administrerade IgG / IgYs. Dessa proteiner har visat orubbliga markörer för de många olika insektsarter som testades hittills. Emellertid, såsom nämnts ovan, är den huvudsakliga begränsningen för användning av IgG / IgYs att de är mycket dyra. Följaktligen Ig…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen kom från USDA CRIS 5347-22620-021-00D och delvis av jordbruks- och livsmedels Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant no. 2011-67009-30141 från USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi är tacksamma för tekniskt stöd från Johanna Nassif. Vi tackar också Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, och Frances Sivakoff för att ge några av de bilder som används i figur 3.
Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |