Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo<em> In-Vitro</em> Ischemia
Summary
Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). Qui, stiamo riportando un metodo pratico di sessuato dell'ippocampo protocollo cultura astrociti al fine di studiare i meccanismi alla base della funzione degli astrociti in cuccioli di neonato maschio e femmina dopo ischemia in vitro.
Abstract
Astrogliosis seguente ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related svolge un ruolo in un aumento della morbilità e mortalità nei neonati. Recenti studi clinici indicano che la gravità della lesione cerebrale sembrano essere il sesso dipendente, e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di lesioni cerebrali HI-correlati, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto alle femmine con lesioni cerebrali simili. Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere le popolazioni altamente arricchito di sessuato astrociti dell'ippocampo è essenziale per comprendere la base cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. In questo studio, si descrive un metodo per la creazione di specifiche culture astrociti dell'ippocampo di sesso che sono sottoposti a un modello di ischemia in vitro, deprivazione di ossigeno e glucosio, seguito da riossigenazione. Successivamente astrogliosi reattiva è stata esaminata dal immunostaining per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e S100B. Questo metodo fornisce un utile strumento per studiare il ruolo del maschio e astrociti dell'ippocampo femminili seguente neonatale HI, separatamente.
Introduction
Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). crescente corpo di evidenze indicano che i ruoli di astrociti sono più di sostegno neuronale. Infatti, i ruoli di astrociti in condizioni fisiologiche possono essere molto complessa, come guidare la migrazione degli assoni sviluppo 1, regolazione del flusso sanguigno CNS 2, mantenendo l'omeostasi pH della sinaptica liquido interstiziale 3, e partecipando la barriera ematoencefalica 4 e 5 la trasmissione sinaptica. In condizioni patologiche, astrociti rispondono al danno con un processo chiamato astrogliosis reattiva in cui la morfologia, numero, la posizione, la topografia (rispetto alla distanza da insulto) e funzione delle astrociti possono cambiare in modo eterogeneo 6,7. Astrogliosis visto seguente neonatale encefalopatia ischemica ipossica forse contribuire alla morbilità e la mortalità dei neonati <sup> 8.
studi clinici e sperimentali recenti indicano che la gravità del danno cerebrale sembra essere il sesso-dipendente e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto a femmine con lesioni cerebrali paragonabili 9-11. Sebbene la localizzazione della lesione dipende dall'età gestazionale e la durata e la gravità dell'insulto, ippocampo è una delle regioni più comunemente effettuata nel SNC dopo termine neonatale HI, e aumentato astrogliosis ippocampo è stato confermato da up-regolazione Protein fibrillare gliale acida (GFAP) 3 d dopo la HI neonatale 7,10,12,13. Differenze di genere nella funzione degli astrociti sono stati mostrati in entrambi i neonati e nei roditori adulti dopo ischemia cerebrale 14,15. Inoltre, maschio suscettibilità astrociti di ischemia in vitro è stato dimostrato da un aumento cell morte rispetto ai astrociti corticali femminili nella cultura 16.
Differenze di sesso iniziano in utero e continuare fino alla morte 17. Negli ultimi dieci anni, l'importanza di includere i sessi in condizioni sperimentali in coltura cellulare e in vivo studi sono stati l'enfasi dell 'Istituto di Medicina e NIH di cercare la conoscenza fondamentale nelle differenze di sesso visto in condizioni fisiologiche e patologiche 17,18 . Sviluppo di metodi affidabili di isolare e mantenere popolazioni di sessuato astrociti dell'ippocampo è essenziale per comprendere le basi cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. Il presente studio è stato progettato per fornire le tecniche per preparare culture dell'ippocampo astrociti sesso-specifici arricchito da topi appena nati al fine di valutare il ruolo degli astrociti GFAP-immunoreattive seguenti ossigeno / glucosio Deprivation (OGD) e riossigenazione (Reox), inducendoHI in ambiente di coltura cellulare. Questa tecnica può essere utilizzata per testare qualsiasi ipotesi di pertinenza astrociti dell'ippocampo nei maschi e nelle femmine neonatali in condizioni normossiche e ischemiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al fine di studiare le differenze di sesso nelle proprietà e la funzione degli astrociti in condizioni fisiologiche e patologiche, la preparazione degli astrociti primari sessuati in coltura cellulare è uno strumento importante da utilizzare. Nel presente studio riportiamo un altamente efficiente e un metodo riproducibile per la cultura di una popolazione omogenea altamente arricchito di astrociti dell'ippocampo sessuati da neonato (P0-P2) C57Bl / 6 (wild type) o K19F (GFAP null) cuccioli di topo in vitro.</em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Outro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
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