Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na<em> In-vitro</em> Ischemie
Summary
Astrocyten een van de belangrijkste belangrijkste spelers in het centrale zenuwstelsel (CNS). Hier worden we melding van een praktische methode van gesekst hippocampus astrocyten cultuur protocol om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de astrocyt functie in de mannelijke en vrouwelijke pasgeboren pups na in-vitro ischemie te bestuderen.
Abstract
Astrogliosis na hypoxie / ischemie (HI) -gerelateerde hersenletsel speelt een rol bij verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij pasgeborenen. Recente klinische studies geven aan dat de ernst van hersenletsel lijken geslacht afhankelijk zijn, en dat de mannelijke pasgeborenen zijn vatbaarder voor de effecten van HI-gerelateerde hersenletsel, hetgeen leidt tot ernstige neurologische gevolgen dan bij vrouwen met vergelijkbare hersenletsel. De ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en te onderhouden sterk verrijkte populaties gesekst hippocampus astrocyten is essentieel voor de cellulaire basis van geslacht verschillen in de pathologische gevolgen van neonatale HI begrijpen. In deze studie beschrijven we een methode waarbij seksespecifieke hippocampale astrocyt culturen die zijn onderworpen aan een model van in vitro ischemie, zuurstof glucose ontbering, gevolgd door reoxygenatie. Latere reactieve astrogliosis werd onderzocht door immunostaining voor de Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en S100B. Deze methode verschaft een bruikbaar instrument om de rol van mannelijke en vrouwelijke hippocampus astrocyten na neonatale HI bestuderen afzonderlijk.
Introduction
Astrocyten een van de belangrijkste belangrijkste spelers in het centrale zenuwstelsel (CNS). Groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal wijst erop dat de rol van de astrocyten zijn meer dan het verstrekken van neuronale ondersteuning. In feite kan de rol van astrocyten onder fysiologische omstandigheden zeer complex zijn, zoals geleiden van de migratie van de ontwikkeling axonen 1, reguleren CNS bloedstroom 2, de pH homeostase van de synaptische interstitiële vloeistof 3, en die aan de bloedhersenbarrière 4 pt 5 synaptische transmissie. Onder pathologische omstandigheden, astrocyten reageren op verwonding met een proces genaamd reactieve astrogliose waarbij de morfologie, aantal, plaats, topografie (ten opzichte afstand van lozing) en functie van de astrocyten kan veranderen in een heterogene wijze 6,7. Astrogliosis waargenomen na neonatale hypoxische ischemische encefalopathie misschien bijdragen tot de morbiditeit en mortaliteit van neonaten <sup> 8.
Recente klinische en experimentele studies geven aan dat de ernst van hersenletsel blijkt sex-afhankelijke zijn en dat de mannelijke pasgeborenen zijn vatbaarder voor de effecten van hypoxie / ischemie (HI) -gerelateerde hersenletsel, hetgeen leidt tot ernstige neurologische resultaten in vergelijking met vrouwen met vergelijkbare hersenletsel 9-11. Hoewel de lokalisatie van het letsel is afhankelijk van de zwangerschapsduur en de duur en de ernst van de belediging, hippocampus is een van de meest bewerkstelligd gebieden in het CNS na term neonatale HI en verhoogde hippocampale astrogliosis is bevestigd door opregulatie van de Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) 3 d na de neonatale HI 7,10,12,13. Sekseverschillen in de astrocyt functie werden getoond in zowel pasgeborenen en volwassenen knaagdieren na cerebrale ischemie 14,15. Bovendien mannelijke astrocytic gevoeligheid voor in vitro ischemie werd aangetoond door verhoogde cell overlijden in vergelijking met vrouwelijke corticale astrocyten in de cultuur 16.
Sekseverschillen starten in de baarmoeder en gaan door tot de dood 17. In het afgelopen decennium is het belang van het opnemen van de seksen in experimentele omstandigheden in celcultuur en in-vivo studies hebben de nadruk van het Institute of Medicine en de NIH om fundamentele kennis te zoeken in de sekseverschillen gezien in fysiologische en pathologische omstandigheden 17,18 . Ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en populaties gesekst hippocampus astrocyten behouden is essentieel voor de cellulaire basis van geslacht verschillen in de pathologische gevolgen van neonatale HI begrijpen. De huidige studie werd ontworpen om de technieken te verstrekken aan verrijkte seksespecifieke hippocampus astrocyten culturen van pasgeboren muizen te bereiden met het oog op de rol van GFAP-immunoreactieve astrocyten volgende Oxygen / Glucose beroving (OGD) en reoxygenatie (Reox), het induceren beoordelenHI in celcultuur omgeving. Deze techniek kan worden gebruikt om een hypothese met betrekking tot de hippocampus astrocyten neonatale mannen en vrouwen onder normoxische en ischemische aandoeningen testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met het oog op de sekseverschillen in de eigenschappen en de functie van astrocyten onder fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen, de voorbereiding van gesekst primaire astrocyten in celkweek is een belangrijk instrument om te gebruiken. In de huidige studie rapporteren we een zeer efficiënte en een reproduceerbare methode om de cultuur van een sterk verrijkt homogene populatie van gesekst hippocampus astrocyten van pasgeboren (P0-P2) C57BL / 6 (wild type) of K19F (GFAP null) muis pups in-vitro….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Outro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
Referências
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- . Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women’s health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
