Geschlechtsunterschiede in Mäuse Hippocampus Astrozyten nach<em> In-Vitro</em> Ischemia
Summary
Astrozyten sind eine der wichtigsten Schlüsselspieler im zentralen Nervensystem (ZNS). Hier berichten wir eine praktische Methode der sexed Hippokampus – Astrozyten Kulturprotokoll , um die zugrunde liegenden Mechanismen der Astrozytenfunktion bei männlichen und weiblichen Neugeborenen Welpen nach In-vitro – Ischämie zu untersuchen.
Abstract
Astrogliose nach Hypoxie / Ischämie (HALLO) -related Hirnverletzung spielt eine Rolle bei einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei Neugeborenen. Neuere klinische Studien zeigen , dass die Schwere der Hirnverletzung erscheinen Geschlecht abhängig zu sein, und dass die männlichen Neugeborenen sind anfälliger für die Auswirkungen von HALLO bezogenen Hirnverletzung, was zu mehr schweren neurologischen Ergebnisse als zu Frauen mit vergleichbaren Hirnverletzungen verglichen. Die Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Isolierung und hochangereichertes Populationen von sexed Hippokampus-Astrozyten halten ist wichtig, die zellulären Grundlagen der Geschlechtsunterschiede in den pathologischen Folgen der Neugeborenen-HALLO zu verstehen. In dieser Studie beschreiben wir ein Verfahren zur geschlechtsspezifischen hippocampal Astrozytenkulturen schaffen , die in vitro zu einem Modell der Ischämie unterzogen werden, Sauerstoff-glucose deprivation, gefolgt von Reoxygenierung. Nachfolgende reaktive Astrogliose wurde von immunostai geprüftning für den sauren Gliafaserproteins (GFAP) und S100B. Dieses Verfahren stellt ein nützliches Werkzeug, um die Rolle der männlichen und weiblichen hippocampalen Astrozyten folgenden neonatal HALLO, separat zu untersuchen.
Introduction
Astrozyten sind eine der wichtigsten Schlüsselspieler im zentralen Nervensystem (ZNS). Immer deutlicher abzeichnet, zeigt an, dass die Rollen von Astrozyten sind mehr als neuronale Unterstützung. In der Tat können die Rollen der Astrocyten unter physiologischen Bedingungen sehr komplex, wie die Wanderung der Entwicklungs Axone 1 Führung Regulieren CNS Blutfluß 2, um den pH – Homöostase des synaptischen Interstitialflüssigkeit 3 und in der Blut – Hirn – Schranke beteiligt 4 und 5 der synaptischen Übertragung. Unter pathologischen Bedingungen reagieren Astrozyten zu Verletzungen im Zusammenhang mit einem Prozess reaktiven Astrogliose genannt , in dem die Morphologie, Anzahl, Lage, Topographie (in Bezug auf Abstand von Insult) und Funktion der Astrozyten in einer heterogenen Weise 6,7 geändert. Astrogliose folgende neonatalen hypoxischen ischämischen Enzephalopathie gesehen vielleicht auf die Morbidität und Mortalität von Neugeborenen beitragen <sbis> 8.
Neuere klinische und experimentelle Studien zeigen, dass die Schwere der Hirnverletzung wird geschlechtsabhängig zu sein und dass die männlichen Neugeborenen anfälliger für die Wirkungen von Hypoxie / Ischämie (HALLO) -bezogene Hirnverletzung, was zu schweren neurologischen Ergebnisse im Vergleich zu Frauen mit vergleichbaren Hirnverletzungen 11.09. Obwohl die Lokalisation der Verletzung auf dem Schwangerschaftsalter und der Dauer und der Schwere der Insult abhängt, ist hippocampus eine der am häufigsten durchgeführt Regionen im ZNS nach der Begriff neonatal HALLO und erhöhte hippocampal Astrogliose durch Hochregulierung von bestätigt die sauren Gliafaserproteins (GFAP) 3 d nach der Neugeborenen HALLO 7,10,12,13. Geschlechtsunterschiede in Astrozytenfunktion wurden in beiden Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren nach zerebraler Ischämie 14,15 gezeigt. Zusätzlich wurde männlichen astrozytären Anfälligkeit für in-vitro Ischämie durch erhöhte cel gezeigtenl Tod im Vergleich zu weiblichen kortikalen Astrozyten in Kultur 16.
Geschlechtsunterschiede beginnen in-utero und weiter bis zum Tod 17. Im Laufe der letzten zehn Jahre von der Bedeutung , die Geschlechter in der experimentellen Bedingungen in Zellkultur mit und in-vivo – Studien haben die Schwerpunkte des Instituts für Medizin und NIH gewesen grundlegende Kenntnisse in den geschlechtsspezifische Unterschiede in der physiologischen und pathologischen Zuständen gesehen zu suchen 17,18 . Entwicklung zuverlässiger Methoden Populationen von sexed Hippokampus-Astrozyten zu isolieren und zu pflegen ist wichtig, die zellulären Grundlagen der Geschlechtsunterschiede in den pathologischen Folgen der Neugeborenen-HALLO zu verstehen. Die vorliegende Studie wurde entworfen, um die Techniken zu bieten angereichertem geschlechtsspezifische hippokampale Astrozytenkulturen von neugeborenen Mäusen vorzubereiten, um die Rollen von GFAP-immunoreaktive Astrozyten zu bewerten folgenden Sauerstoff / Glukose-Deprivation (OGD) und Reoxygenierung (Reox), induzierenHALLO in Zellkulturumgebung. Diese Technik kann verwendet werden, um eine Hypothese zu testen, in Bezug auf Hippokampus-Astrocyten in neonatal Männchen und Weibchen unter normoxischen und ischämischen Zuständen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die geschlechtsspezifische Unterschiede in den Eigenschaften und Funktion der Astrozyten unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, die Vorbereitung von sexed primären Astrozyten in der Zellkultur ist ein wichtiges Instrument zu nutzen. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine hocheffiziente und ein reproduzierbares Verfahren zur Kultur ein hochangereichertes homogene Population von sexed Hippokampus – Astrozyten von Neugeborenen (P0-P2) C57Bl / 6 (Wildtyp) oder K19F (GFAP null) …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Outro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
Referências
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