माउस hippocampal astrocytes में सेक्स अंतर के बाद<em> इन-विट्रो</em> Ischemia
Summary
Astrocytes केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे महत्वपूर्ण प्रमुख खिलाड़ियों में से एक हैं। यहाँ, हम तंत्र के बाद इन विट्रो ischemia पुरुष और महिला नवजात शिशु पिल्ले में astrocyte समारोह अंतर्निहित का अध्ययन करने के क्रम में sexed हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृति प्रोटोकॉल का एक व्यावहारिक विधि रिपोर्टिंग कर रहे हैं।
Abstract
हाइपोक्सिया / ischemia (एचआई) से संबंधित मस्तिष्क की चोट के बाद Astrogliosis वृद्धि की रुग्णता और नवजात शिशुओं में मृत्यु दर में एक भूमिका निभाता है। हाल ही में नैदानिक अध्ययन से संकेत मिलता है कि मस्तिष्क की चोट की गंभीरता सेक्स निर्भर होना दिखाई देते हैं, और पुरुष नवजात शिशुओं और अधिक गंभीर स्नायविक परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप तुलनीय मस्तिष्क की चोटों के साथ महिलाओं की तुलना में एचआई से संबंधित मस्तिष्क की चोट के प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि,। विश्वसनीय तरीकों के विकास के लिए अलग और sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes की अत्यधिक समृद्ध आबादी बनाए रखने के लिए नवजात HI के रोग परिणामों में लिंग भेद के सेलुलर आधार को समझने के लिए आवश्यक है। इस अध्ययन में, हम सेक्स विशिष्ट हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों है कि इन विट्रो ischemia, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव के एक मॉडल, reoxygenation के द्वारा पीछा के अधीन हैं बनाने के लिए एक विधि का वर्णन है। इसके बाद प्रतिक्रियाशील astrogliosis immunostai द्वारा जांच की गई थीGlial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और S100B के लिए निंग। इस विधि, नवजात HI निम्नलिखित पुरुष और महिला हिप्पोकैम्पस astrocytes की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अलग से एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
Astrocytes केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे महत्वपूर्ण प्रमुख खिलाड़ियों में से एक हैं। सबूत की बढ़ती शरीर इंगित करता है कि astrocytes की भूमिकाओं न्यूरोनल सहायता प्रदान करने की तुलना में अधिक हैं। वास्तव में, शारीरिक शर्तों के तहत astrocytes की भूमिका जैसे विकासशील एक्सोन 1 के प्रवास के मार्गदर्शक, सीएनएस रक्त के प्रवाह को विनियमित 2, synaptic मध्य द्रव 3 का पीएच homeostasis को बनाए रखने, और रक्त मस्तिष्क बाधा में भाग लेने के रूप में, बहुत जटिल हो सकता है 4 और 5 synaptic प्रसारण। रोग की स्थिति के तहत, astrocytes एक प्रक्रिया प्रतिक्रियाशील astrogliosis जिसमें आकृति विज्ञान, संख्या, स्थान, स्थलाकृति astrocytes की और समारोह (अपमान से दूरी के संबंध में) एक विषम रास्ता 6.7 में बदल सकता है कहा जाता है के साथ चोट का जवाब। देखा Astrogliosis नवजात hypoxic इस्कीमिक मस्तिष्क विकृति शायद रुग्णता और नवजात शिशुओं की मृत्यु दर में योगदान करने के बाद <s> 8 तक।
हाल ही में नैदानिक और प्रायोगिक अध्ययन से संकेत मिलता है मस्तिष्क की चोट की गंभीरता सेक्स पर निर्भर होना प्रतीत होता है कि पुरुष और नवजात शिशुओं, और अधिक गंभीर स्नायविक परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में हाइपोक्सिया / ischemia (एचआई) से संबंधित मस्तिष्क की चोट के प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि तुलनीय मस्तिष्क की चोटों 9-11 साथ महिलाओं। हालांकि चोट के स्थानीयकरण गर्भावधि उम्र और अवधि और अपमान की गंभीरता पर निर्भर करता है, हिप्पोकैम्पस सबसे अधिक प्रभावित अवधि नवजात HI बाद सीएनएस में क्षेत्रों में से एक है, और वृद्धि हिप्पोकैम्पस astrogliosis अप-विनियमन के द्वारा पुष्टि की गई है Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) 3 डी नवजात HI 7,10,12,13 के बाद। Astrocyte समारोह में सेक्स मतभेद मस्तिष्क ischemia 14,15 के बाद दोनों नवजात शिशुओं और वयस्क कृन्तकों में दिखाया गया। इसके अलावा, इन विट्रो ischemia के लिए पुरुष astrocytic संवेदनशीलता में वृद्धि हुई सेल द्वारा दिखाया गया थाएल मौत संस्कृति 16 में महिला cortical astrocytes की तुलना में।
सेक्स मतभेदों में गर्भाशय शुरू करते हैं और मृत्यु 17 तक जारी है। पिछले दशक के दौरान, सेल संस्कृति में है और इन विवो अध्ययनों प्रयोगात्मक शर्तों में लिंगों सहित के महत्व को चिकित्सा और एनआईएच के संस्थान के जोर सेक्स शारीरिक और रोग की स्थिति 17,18 में देखा मतभेद में मौलिक ज्ञान की तलाश करने के लिए किया गया है । विश्वसनीय तरीकों का विकास अलग और sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes की आबादी बनाए रखने के लिए नवजात HI के रोग परिणामों में लिंग भेद के सेलुलर आधार को समझने के लिए आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन के आदेश के बाद ऑक्सीजन / ग्लूकोज अभाव (OGD) और reoxygenation (REOX), उत्प्रेरण GFAP-immunoreactive astrocytes की भूमिका का आकलन करने में नवजात चूहों से समृद्ध सेक्स-विशिष्ट हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों तैयार करने के लिए तकनीक प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया थासेल संस्कृति वातावरण में HI। इस तकनीक normoxic और इस्कीमिक की शर्तों के तहत नवजात पुरुषों और महिलाओं में हिप्पोकैम्पस astrocytes से संबंधित किसी भी परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेक्स शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत astrocytes के गुणों में मतभेद और समारोह का अध्ययन करने के लिए, सेल संस्कृति में sexed प्राथमिक astrocytes की तैयारी का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। वर्तमान अध्ययन में ह…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Outro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
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