Kjønnsforskjeller i Muse Hippokampale Astrocytter etter<em> In-Vitro</em> iskemi

Summary

Astrocytter er en av de viktigste nøkkelspillere i sentralnervesystemet (CNS). Her rapporterer vi en praktisk metode for sexed hippocampus astrocyte kultur protokoll for å studere mekanismene bak astrocyte funksjon i mannlige og kvinnelige nyfødte valper etter in vitro iskemi.

Abstract

Astrogliosis følgende hypoksi / iskemi (HI) -relaterte hjerneskade spiller en rolle i økt sykelighet og dødelighet hos nyfødte. Nyere kliniske studier indikerer at graden av hjerneskade synes å være sex avhengig, og at de mannlige nyfødte er mer utsatt for virkningene av HI-relaterte hjerneskade, noe som resulterer i mer alvorlige nevrologiske utfall sammenlignet med kvinner med tilsvarhjerneskader. Utviklingen av pålitelige metoder for å isolere og opprettholde høyanriket populasjoner av sexed hippocampus astrocytter er viktig å forstå den cellulære grunnlag av kjønnsforskjeller i de patologiske konsekvenser av neonatal HI. I denne studien, beskriver vi en fremgangsmåte for å lage kjønnsspesifikke hippocampus astrocyttkulturer som er utsatt for en modell for in-vitro-ischemi, oksygen-glukosemangel, etterfulgt av reoksygenering. Etterfølgende reaktiv astrogliosis ble undersøkt av immunostaining for Glial Fibrillary Surt Protein (GFAP) og S100B. Denne metoden gir et nyttig verktøy for å studere rollen til hann- og hunn hippocampus astrocytter følgende neonatal HI, hver for seg.

Introduction

Astrocytter er en av de viktigste nøkkelspillere i sentralnervesystemet (CNS). Økende bevis indikerer at rollene som astrocytter er mer enn å gi nevronale støtte. Faktisk kan rollene til astrocytter under fysiologiske betingelser være meget komplekse, for eksempel styring av migrasjon av utviklings aksoner ^1, regulerer CNS blodstrøm ^2, å opprettholde pH homeostase av den synaptiske interstitiell væske ^3, og som deltar i blod-hjerne-barrieren ⁴ og synaptisk transmisjon ^fem. Under patologiske tilstander, astrocytter svare på skade med en prosess som kalles reaktiv astrogliosis hvori morfologien, antall, plassering, topografi (med hensyn til avstand fra fornærmelse) og funksjon av astrocyttene kan endre seg i en heterogen måte ^6,7. Astrogliosis sett følgende neonatal hypoksisk iskemisk encefalopati kanskje bidrar til sykelighet og dødelighet av nyfødte <sopp> 8.

Nylige kliniske og eksperimentelle studier indikerer at graden av hjerneskade synes å være kjønnsavhengig, og at de mannlige nyfødte er mer utsatt for virkningen av hypoksi / ischemi (HI) -relaterte hjerneskade, noe som resulterer i mer alvorlige nevrologiske utfall sammenlignet kvinner med sammenlignbare hjerneskader ^9-11. Selv om lokalisering av skaden er avhengig av fosterets alder og varigheten og alvorlighetsgraden av fornærmelse, er hippocampus en av de mest vanlig bevirkes områder i CNS etter betegnelsen neonatal HI, og økt hippocampus astrogliosis er blitt bekreftet ved oppregulering av den Glial Fibrillary Surt Protein (GFAP) 3 d etter neonatal HI ^7,10,12,13. Kjønnsforskjeller i astrocyte funksjon ble vist i både nyfødte og voksne gnagere etter cerebral iskemi ^14,15. I tillegg ble hann astrocytic mottakelighet for in-vitro-ischemi vist ved øket cell død sammenlignet med kvinnelige kortikale astrocytter i kultur ^16.

Kjønnsforskjeller start in-utero og fortsetter til døden ^17. I løpet av det siste tiåret, har betydningen av å inkludere kjønnene i eksperimentelle forhold i cellekultur og i-vivo studier vært vektlegging av Institute of Medicine og NIH til å søke grunnleggende kunnskap i kjønnsforskjeller sett i fysiologiske og patologiske tilstander ^17,18 . Utvikling av pålitelige metoder for å isolere og opprettholde bestandene av sexed hippocampus astrocytter er viktig å forstå den cellulære grunnlag av kjønnsforskjeller i de patologiske konsekvenser av neonatal HI. Denne studien er designet for å gi teknikker for å forberede beriket kjønnsspesifikke hippocampus astrocyttkulturer fra nyfødte mus for å vurdere rollene til GFAP-immunoreaktive astrocytter følgende Oxygen / glukose deprivasjon (OGD) og Reoksygeneringen (Reox), indusereHI i cellekultur miljø. Denne teknikken kan brukes til å teste en hvilken som helst hypotese med hensyn til hippocampus-astrocytter i neonatale hanner og hunner i henhold til normoksisk og iskemiske tilstander.

Protocol

MERK: Denne studien ble gjennomført i samsvar med anbefaling fra Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Health. Dyret protokollen ble godkjent av University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care og bruk komité. Primær astrocyte Kultur protokoll som er presentert her er adoptert fra protokollene som presenteres av Zhang Y 19 mfl. Og Cengiz P 20 mfl. Med noen modifikasjoner. 1. hippocampus Dissection og astrocyte Kultur Forber…

Representative Results

Forstå roller kjønnede astrocyttkulturer fungerer under fysiologiske eller patofysiologiske tilstander har blitt umåtelig belyst ved å dyrke disse cellene under in vitro betingelser. Det viktige aspektet med å utføre seksuelle dyrkning, er å bestemme kjønn av musen pup før bruk. Vi har fastslått kjønn på mus genetisk ved PCR og ved visuell vurdering (figur 2) 16. Metodikken for kjønnsbestemmelse ved hjelp av PCR ble vedtatt med endringer …

Discussion

For å studere kjønnsforskjeller i egenskaper og funksjon av astrocytter under fysiologiske og patologiske tilstander, utarbeidelse av kjønnede primære astrocytter i cellekultur er et viktig verktøy for å utnytte. I denne studien rapporterer vi en svært effektiv og reproduserbar metode for å kultur et høyanriket homogen befolkning på kjønnede hippocampus astrocytter fra nyfødt (P0-P2) C57Bl / 6 (villtype) eller K19F (GFAP null) museunger in vitro. Etablering av denne metodikken hjelper etterforskerne…

Materials

Astrocyte culture media
DMEM, high glucose	cellgro	10-013-CV
Horse serum	Gibco	26050-070	Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin	Cellgro	30-002-CI	Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride	Aldrich	L1002-25G	Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
0.25% Trypsin	cellgro	25-050-CI	Final Concentration: 0.25%
Outro
70% (vol/vol) ethanol	Roth	9065.2
Poly-D-Lysine 12mm round coverslips	Corning	354087
Water	Sigma	W3500	cell culture grade
PBS	cellgro	21-040-CV	cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-062
70 μm Sterile cell strainer	Fisher scientific	22363548
3.5 cm petri dish	BD Falcon	353001
15 ml Falcon tube	BD Falcon	352096
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070
Forceps, fine	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
Forceps, flat tip	KLS Martin	12-120-11
13 cm surgical scissors	Aesculap	BC-140-R
Confocal Microscope	Nikon	A1RSi
Centrifuge	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Anti-IBA1	Wako	019-19741	Rabbit monoclonal
Anti-MAP2	Sigma	M2320	Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha	abcam	ab179483	rabbit monoclonal
Anti-S100B	Sigma	HPA015768	Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail)	Biolegend	837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector Labs	PK-6101	Contains 4 Reagents
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488	Invitrogen	A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568	Invitrogen	A11004