Половые различия в мышином гиппокампа астроцитов после<em> In-Vitro</em> ишемия
Summary
Астроциты являются одним из наиболее важных ключевых игроков в центральной нервной системе (ЦНС). Здесь мы приводим практический метод Sexed гиппокампа протокола астроцитов культуры с целью изучения механизмов , лежащих в основе функции астроцитов в мужских и женских новорожденных мышат после того, как в лабораторных условиях ишемии.
Abstract
Астроглиоза следующие гипоксия / ишемия (HI) черепно-мозговой травмой о связанных играет определенную роль в росте заболеваемости и смертности новорожденных. Недавние клинические исследования указывают на то, что тяжесть черепно – мозговой травмы , как представляется, секс зависит, и что мужчины новорожденные более восприимчивы к воздействию HI-связанной травмы головного мозга, что приводит к более тяжелых неврологических осложнений по сравнению с женщинами с сопоставимыми черепно – мозговых травм. Разработка надежных методов, чтобы изолировать и поддерживать высокую обогащенные популяции Sexed гиппокампа астроцитов имеет важное значение для понимания клеточной основы половых различий в патологических последствий новорожденных HI. В данном исследовании мы опишем метод для создания секс – специфические гиппокампа культуры астроцитов , которые подвергаются модели в лабораторных условиях ишемии, кислородно-глюкозы лишения, с последующим реоксигенация. Последующее реактивная астроглиоз был осмотрен immunostaiнин для глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и S100B. Этот метод является полезным инструментом для изучения роли мужского и женского пола гиппокампа астроцитов следующий новорожденных HI, отдельно.
Introduction
Астроциты являются одним из наиболее важных ключевых игроков в центральной нервной системе (ЦНС). Все больше фактов указывает на то, что роли астроцитов больше, чем предоставление поддержки нейронов. На самом деле, роли астроцитов в физиологических условиях может быть очень сложным, например, направляя миграцию развивающихся аксонов 1, регулируя ЦНС кровотока 2, поддерживая рН гомеостаза синаптическую межклеточной жидкости 3, а также участвует в гематоэнцефалического барьера 4 и 5 синаптической передачи. При патологических условиях, астроциты реагируют на повреждения с помощью процесса , называемого реактивного астроглиоз , в котором морфология, количество, расположение, рельеф местности (по расстоянию от инсульта) и функции астроцитов может измениться в гетерогенной образом 6,7. Астроглиоза видел следующие неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатии, возможно, вносит свой вклад в заболеваемость и смертность новорожденных <sдо 8>.
Недавние клинические и экспериментальные исследования указывают на то, что тяжесть черепно-мозговой травмой, как представляется, секс-зависимым и что мужчины новорожденные более восприимчивы к воздействию гипоксии / ишемии (HI) черепно-мозговой травмой о связанных, в результате чего в более тяжелых неврологических осложнений по сравнению с самки с сопоставимыми черепно – мозговых травм 9-11. Хотя локализация повреждения зависит от гестационного возраста и продолжительности и степени тяжести инсульта, гиппокамп является одним из наиболее часто осуществляется областей в ЦНС после срока новорожденных HI, и увеличилась гиппокампа астроглиоз подтверждена повышающую регуляцию протеин глиального фибриллярного Кислая (GFAP) 3 d после неонатального HI 7,10,12,13. Половые различия в функции астроцитов были показаны в обоих новорожденных и взрослых грызунов после ишемии головного мозга 14,15. Кроме того, мужчина астроцитов восприимчивость к экстракорпорального ишемии проявляется увеличением CELл смерть по сравнению с женским корковых астроцитов в культуре 16.
Половые различия начинаются в утробе матери и продолжается до смерти 17. За последнее десятилетие, важность включения полов в экспериментальных условиях в клеточной культуре , так и в естественных условиях исследования были акцент Института медицины и NIH искать фундаментальные знания в половые различия видели в физиологических и патологических состояниях 17,18 , Разработка надежных методов для выделения и сохранения популяций Sexed гиппокампа астроцитов имеет важное значение для понимания клеточной основы половых различий в патологических последствий новорожденных HI. Настоящее исследование было разработано, чтобы обеспечить методы для подготовки обогащенные секс-специфические гиппокампа астроцитов культуры от новорожденных мышей с целью оценки роли GFAP-иммунореактивных астроцитов следующих кислорода / глюкозы Лишение (OGD) и реоксигенация (REOX), вызываяHI в среде клеточной культуры. Этот метод может быть использован для тестирования любую гипотезу, имеющую отношение к гиппокампа астроцитов у новорожденных самцов и самок при нормоксических и ишемических состояний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для изучения половых различий в свойствах и функции астроцитов при физиологических и патологических состояниях, подготовка Sexed первичных астроцитов в культуре клеток является важным инструментом для использования. В настоящем исследовании мы сообщаем высокоэффективным и воспроизв?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Outro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
Referências
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- . Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women’s health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
