착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근
Summary
이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
착상 전 배아 발달이 상실 배와 배반포로 한 세포 단계에서, 여러 가지 구별되는 단계로 나눌 수있다. 많은 증거가 극성 위치 단서가 trophectoderm (TE) 및 내부 세포괴 (ICM)에 이른 세포 운명 결정에 중요한 역할을 제안합니다. 그러나, 셀룰러 신호로 형질 도입 방법을 단서의 특성 및 생리적 컨텍스트는 이러한 신호들은 알려지지 않은 세포 계통의 분화를 개시 할 수있다. 이 분화 된 세포는 태반 1-3의 배아 적절한 형성과 성장에 필요한 특성 구조와 기능에 걸릴 시작, 전문화를 받다.
착상 전 배아의 siRNA 또는 표적 cDNA의 변성 등의 유전 재료의 직접적인 주사에 의한 조작에 특히 순종하며, 따라서 특정 표적 분자를 연구하는데 이용 될 수있다. 유전이 성장 이해가척추 동물 배아의 분석은 배아 발달 4에 대한 우리의 이해를 발전에 매우 중요합니다. 적시 문맥 배아 내로 야생형 유전자 또는 돌연변이 형태의 정밀한 도입 이득 – 또는 기능 상실 유전자 크게 발달 조절 유전자에 대한 연구를 촉진했다 수행한다. Loss- 및 이득의 기능 개별 이른 비 포유 동물과 포유 동물의 배아에 유전 물질의 미세 주입을 통해 이유로 인해 그들의 큰 크기와 큰 감수성 (5)의 상대적으로 간단하다. 마이크로 인젝션은 전형적으로 비 – 바이러스 성 벡터를 사용하여 수행된다. 특별한 장점은 바이러스 벡터 및 유전자 위에 비 바이러스 성 벡터를 사용의 용이성이 고려되어왔다. 마우스 배아 급격한 loss- 또는 기능 획득 발현 시스템은 우리 해부 척추 동물 배아 -6,7- 유전자 기능을 이해할 수 있도록 개발되어왔다.
배아의 형광 라벨이 크게 MICR의 선택을 용이하게 할oinjected 또는 유 전적으로 조작 된 배아를 동시에 간접 형광 강도 (8)에 기초하여 마이크로 인젝션의 siRNA 또는 cDNA의 발현 수준을 정량 할 수있는 수단을 부여. 이 라벨 형광 단백질 cDNA를, GFP 또는 RFP를 달성하기 위해 공동 주입 융합 구조물 또는 별도로 하나 같다. GFP 또는 RFP의 형광 강도는 loss- 보장 또는 기능 획득 이루어진 것으로하기의 siRNA 또는 외부 DNA의 발현의 정도를 보여준다.
여기, 우리는 우리가 착상 마우스 배아의 초기 세포 분화에 중요한 세포 외 신호를 중계하는 수용체로 neogenin 식별 할 수 loss- 이득 외 기능 기술에 대한 미세 조작 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜에서, 우리는 마우스 배아 초기의 세포 분화에 neogenin의 역할을 탐구하는 2-PN 마우스 배아에 유전 물질의 미세 주사의 새로운 방법, cDNA를 또는 shRNA를 하나를 보여줍니다. 착상 전 배아의 유전자 변형은 예를 들어 대한 기본 분자 메커니즘, 첫 번째 셀의 혈통 결정에 대한 주요 정보를 폭로에서 강력한 기술이다. 유전 적 변형은 유전자의 기능을 확인하는 가장 일반적으로 사용되는 방?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 또한 제조 및 cDNA를과의 shRNA 벡터를 neogenin의 구조를 공유 조지아 건강 과학 대학에서 박사 시옹의 그룹을 인정하고 싶습니다. 본 연구는 한국 연구 재단의 자금을 지원 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A4A01012572)에서 보조금과 삼육 대학에서 연구비에 의해 지원되었다.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
Referências
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