Syntes av värmegelande Poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat Composites med alginatmikropartiklar för Tissue Engineering
Summary
En injicerbar vävnadsteknik scaffold sammansatt av poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat (PNIPAAm-g-CS) -innehållande alginatmikropartiklar framställdes. Vidhäftningsstyrkan, svullnad egenskaper och in vitro biokompatibilitet analyseras i denna studie. Karakteriseringen tekniker som utvecklats här kan tillämpas på andra värmegelande system.
Abstract
Injicerbara biomaterial definieras som implanterbara material som kan införas i kroppen som en vätska och stelna in situ. Sådana material ger de kliniska fördelarna av att vara implanterade minimalt invasivt och enkelt bildar utrymmesfyllande fasta ämnen i oregelbundet formade defekter. Injicerbara biomaterial har allmänt undersökts som ställningar för vävnadsteknik. Men för reparation av vissa bärande områden i kroppen, såsom mellankotskivan, byggnadsställningar bör ha limegenskaper. Detta kommer att minimera risken för förskjutning under rörelse och säkerställa intim kontakt med den omgivande vävnaden, vilket ger tillräcklig kraftöverföring. Här beskriver vi framställning och karakterisering av en byggnadsställning som består av värmekänsligt poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat (PNIPAAM-g-CS) och alginatmikropartiklar. Den PNIPAAm-g-CS-sampolymeren bildar en viskös lösning i vatten vid RT, i vilken alginate partiklarna är suspenderade för att förbättra vidhäftningen. Ovanför den undre kritiska lösningstemperaturen (LCST), omkring 30 ° C, bildar sampolymeren en fast gel runt mikropartiklarna. Vi har anpassat standard biomaterial karakteriseringsförfaranden för att ta hänsyn till den reversibla fasövergången för PNIPAAm-g-CS. Resultaten tyder på att införlivandet av 50 eller 75 mg / ml alginat partiklar till 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS lösningar fyrdubbla den adhesiva draghållfasthet av PNIPAAm-GCS ensamt (p <0,05). Införlivandet av alginatmikropartiklar också avsevärt ökar svällningsförmåga av PNIPAAm-g-CS (p <0,05), bidrar till att upprätthålla en rymdfyllande gel inom vävnadsdefekter. Slutligen resultaten av in vitro-toxikologi analyssats, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-karboxanilid (XTT) och Live / Dead viabilitetsanalys indikerar att lim är i stånd att stödja överlevnad och spridning av inkapslat humana embryonala njur (HEK) 293 calnar över 5 dagar.
Introduction
Injicerbara biomaterial är sådana som kan lämpligen administreras in i kroppen som en vätska och stelna in situ. Sådana material har tillämpats i stor utsträckning i regenerativ medicin, där de används för att leverera inkapslade cellerna till det påverkade området 1-4 och fungera som en tre-dimensionell temporär extracellulär matrix för cellerna 5. För patienten, injicerbara biomaterial är fördelaktiga eftersom de kirurgiska procedurer för implantation är minimalt invasiva och den fasta fasen kan fylla oregelbundet formad vävnadsdefekter, vilket eliminerar behovet av specialstorlek implantat.
Inmatnings kan åstadkommas genom en mängd olika mekanismer. Externa faktorer, som pH, har undersökts som en utlösande faktor för bildandet av geler som kapslar in celler och bioaktiva molekyler 6-8. Dock kan pH inte vara det mest bekväma avtryckaren för att använda i alla fysiologiska miljöer. En annan traditionell alternativ för att uppnå inmatnings använder in situ kemisk polymerisation eller tvärbindning. En grupp utvecklade en vattenlöslig redoxsystem bestående av ammoniumpersulfat och N, N, N ', N-tetrametyletylendiamin och använde den för reaktion makromerer sammansatta av polyetylenglykol och poly (propylen) glykol 9,10. Zan et al. 11 utvecklade injicerbara kitosan polyvinylalkohol nätverk tvärbunden med glutaraldehyd. I sådana system måste cytotoxiciteten av reaktiva komponenter övervägas, särskilt för tillämpningar som innefattar cellinkapsling. Dessutom kan exotermisk polymerisation producera tillräckligt höga temperaturer för att kompromissa omgivande vävnad, vilket har rapporterats för polymer bencement 12,13.
Ytterligare andra injicerbara polymersystem har utvecklats som uppvisar en förändring från flytande till fast tillstånd med temperaturen som utlösare. Känd som värmegelande system, dessa är aqueooss polymerlösningar som inte kräver kemiska stimulus, monomerer eller tvärbindningsmedel för att uppnå in situ-bildning 14. Snarare, en fasövergång vanligtvis uppstår i närheten av fysiologisk temperatur inducerar bildningen av ett fysikaliskt tvärbundet tredimensionellt nätverk. Poloxamerer såsom Pluronic F127 är bland de mest studerade polymerer för värmegelande drug delivery 15-17 och cellinkapslings 18,19. Emellertid är det väl accepterat att dessa geler sakna stabilitet vid fysiologiska betingelser. Studier har visat någon ökad stabilitet genom att använda kedjeförlängare 20 eller kemiska tvärbindningsmedel 21,22. Icke desto mindre kan användningen av dessa reagens begränsa potentialen hos de material för cellinkapsling.
Poly (N-isopropylakrylamid) är en syntetisk värmegelande polymer som har fått stor uppmärksamhet i vävnadsteknik och drug delivery 14. Vattenlösningar av poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) uppvisar en lägre kritiska lösningstemperaturen (LCST), vanligt förekommande runt 32-34 ° C 23,24. Nedanför LCST, hydrater vatten PNIPAAm kedjor. Över övergångstemperaturen, blir polymeren hydrofob, vilket resulterar i en dramatisk fasseparation 25-27 och bildning av en fast gel utan användning av toxiska monomerer eller tvärbindningsmedel. Men PNIPAAm homo uppvisar dåliga elastiska egenskaper och hålla lite vatten vid fysiologiskt temperatur på grund av hydrofobicitet 28. I detta arbete väljer vi att införliva kondroitinsulfat kovalent till PNIPAAm nätverket, vilket ger potential för enzymatisk nedbrytbarhet 29, anti-inflammatorisk aktivitet 30,31 och ökad vatten och näringsämnen absorption 32. PNIPAAm sampolymerer med CS framställdes i vårt laboratorium genom att polymerisera monomeren NIPAAm i närvaro av metakrylat-funktionaliserade CS för att bilda ympade sampolymeren (PNIPAAm-g-CS). because av den låga tvärbindningstäthet av sampolymeren, PNIPAAm-g-CS bildar en viskös lösning i vatten vid RT och en elastisk gel vid fysiologisk temperatur på grund av LCST 29. Polymerlösningarna blir flytande igen vid kylning under LCST grund av reversibilitet övergången.
Vi har visat att PNIPAAm-g-CS har potential att fungera som ett vävnadsteknik byggnadsställning, på grund av mekaniska egenskaper som kan skräddarsys, nedbrytbarhet och cytocompatibility med humana embryonala njur (HEK) 293-celler 29. Men i vissa lastbärande områden, såsom intervertebral skiva, bör vävnadstekniska byggnadsställningar har förmågan att bilda en väsentlig gränssnitt med omgivande skiva vävnad för att eliminera risken för luxation 33. Detta gränssnitt är också nödvändig för att tillräckligt kraftöverföringen över gränssnittet mellan implantatet och vävnaden 33. I vårt arbete har vi stängt av enlginate mikropartiklar i vattenlösningar av PNIPAAm-g-CS och fann att gelning lokaliserar mikropartiklarna, som ger vidhäftning med omgivande vävnad 34. I detta papper, vi beskriva stegen för framställning av värmegelande, vidhäftande polymer. Standardtekniker för biomaterial karakterisering, cell imaging och analyser för lönsamhet har anpassats för att ta hänsyn till temperaturkänslighet av polymeren och reversibilitet fasövergång. Den injicerbara polymer som beskrivs i detta dokument har bred potential för drug delivery och vävnadstekniska tillämpningar utanför de som beskrivs i detta dokument. Dessutom kan karakteriseringsmetoder som beskrivs här tillämpas på andra värmegelande system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga steg i syntetisera hydrogel-mikropartikel komposit och utvärdera sin häftförmåga, svullnad förmåga och cellulära biokompatibilitet. Friradikalpolymerisation av PNIPAAm-g-CS kräver ett framgångsrikt methacrylation av kondroitinsulfat, fullständig upplösning av monomerkomponenter, och syrefria reaktionsbetingelser. Förhållandet mellan NIPAAm monomer metakrylerat kondroitinsulfat i reaktionsblandningen valdes eftersom det har visats i vårt tidigare arbete, för att generera sampolymere…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacksamt erkänna hjälp av Dr Jennifer Kadlowec i utvecklingen av vidhäftande dragprovningsprotokoll.
Research rapporterade i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar och National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering av National Institutes of Health i Award Antal 1R15 AR 063.920 till 01. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
Referências
- Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
- Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
- Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
- Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
- Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
- Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
- Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
- Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
- Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
- Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
- Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
- Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
- Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
- Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
- Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
- Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
- Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
- Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
- Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
- Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
- Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
- Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
- Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
- Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
- Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
- Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
- Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
- Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
- Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
- Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
- Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
- Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
- Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
- Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend’homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
- Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
- Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
- Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park, K., D, Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
- Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
- Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
- Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
- Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
- Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
- Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
- Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
- Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).
