में क्रिस्टलीय सेलूलोज़ संचय के उच्च संकल्प मात्रा<em> Arabidopsis</em> जड़ें ऊतक विशेष सेल की दीवार संशोधनों नजर रखने के लिए
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
संयंत्र सेल दीवार एक गतिशील संरचना है। बढ़ कोशिकाओं एक प्राथमिक सेल की दीवार, संगठन है जो की कोशिकाओं का विस्तार करने की अनुमति देता से घिरे हैं। कोशिकाओं है कि जमा एक और अधिक कठोर माध्यमिक दीवार है कि संयंत्र के यांत्रिक समर्थन बढ़ाता विकसित करने के लिए संघर्ष। दोनों सेल दीवारों सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के विभिन्न संरचनाओं (जैसे, hemicellulose और पेक्टिन) कि विभिन्न विकास मंच के पार भिन्न है और 1,2 ऊतकों की polysaccharides के एक मैट्रिक्स में एम्बेडेड से बना रहे हैं। सेल्यूलोज (1,4) -β-D-glucan की जंजीरों कि कसकर एक क्रिस्टलीय संरचना के सूक्ष्मतंतु फार्म के लिए गठबंधन कर रहे हैं के रूप में संश्लेषित है। बेढब सेल्यूलोज क्षेत्रों में जहां Glucan चेन कम आदेश दिए हैं करने के लिए संदर्भित करता है। क्रिस्टलीय और अनाकार डोमेन के बीच अनुपात एक पैरामीटर सेल की दीवार के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करने के बारे में सोचा, यांत्रिक शक्ति और viscoelastic विशेषता क्रमश: 3 प्रदान कर रहा है। कई तरीकों से किया गया हैका पता लगाने और एक्स-रे विवर्तन और पार ध्रुवीकरण / जादू कोण ठोस राज्य एनएमआर 4 कताई सेल्यूलोज व्यवस्था के दो रूपों यों, उन के बीच करने के लिए विकसित की है। एक्स-रे विवर्तन नमूना 5 में क्रिस्टलीय बनाम अनाकार सेल्यूलोज डोमेन के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक वैकल्पिक तरीका एसिड अघुलनशील और एसिड में घुलनशील सामग्री में कोशिका दीवार सामग्री के विभाजन का उपयोग करता है, क्रिस्टलीय और अनाकार सेलूलोज या अन्य पॉलिमर के बीच भेद करने के लिए क्रमशः। इस दृष्टिकोण में, लेबल ग्लूकोज ([14 सी] ग्लूकोज) के समावेश सेल्यूलोज 6.7 यों इस्तेमाल किया जाता है। इन विधियों पूरे अंग विश्लेषण करती है, पर अच्छे के लिए संयंत्र सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, और इसलिए, अपर्याप्त कोशिका दीवार संरचना में ऊतक विशेष परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं। एक सेलुलर संकल्प पर सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के दृश्य लाइव इमेजिंग अध्ययन फ्लोरोसेंट रंगों 8,9 के साथ संयुक्त में प्राप्त किया जा सकता है, उस में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैंसेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण। हालांकि, इन रंगों मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, वे सेल्यूलोज क्रिस्टलीय के लिए विशिष्ट नहीं कर रहे हैं और कोशिका दीवार 8 की सामान्य संरचना के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। Polscope एक इमेजिंग तकनीक है कि क्रिस्टलीय सेल्यूलोज की क्षमता प्रकाश बीम विभाजित है और प्रकाश 10 का हिस्सा मंदबुद्धि पर निर्भर करता है। लाइट मंदता सूक्ष्मतंतु कि प्रकाश प्रसार की दिशा के लंबवत झूठ के लिए सबसे मजबूत है। इसी तरह के उन्मुखीकरण के साथ सूक्ष्मतंतु के लिए, उच्च स्फटिकता की डिग्री, बड़ा प्रकाश retardance 11। इसलिए, polscope दोनों रिश्तेदार का स्तर और सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
जड़ें, रैखिक वृद्धि, जिसके दौरान कोशिकाओं को स्टेम सेल आला पर होने वाले, जड़ की नोक पर प्रदर्शन कोशिका विभाजन की एक श्रृंखला से गुजरना, इससे पहले कि वे तेजी से 12 का विस्तार। जड़ जिसमें कोशिकाओं को एक दिशाहीन (anisotropic) में विस्तारढंग से, के रूप में छोटे अणु के संकेत हार्मोन है कि सेल की दीवार 13 के गुणों के प्रभाव से तय है। हार्मोन के अंतर प्रतिक्रियाओं, समय और स्थान में, संतुलित विकास अंग 14 सुनिश्चित करने का एक साधन प्रदान करते हैं। इसलिए, सेल दीवार संरचना के उच्च संकल्प विश्लेषण महत्वपूर्ण जानकारी बेहतर पूरे अंग विकास के लिए सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के बीच संबंध समझने के लिए आवश्यक प्रदान कर सकते हैं। यहाँ, हम के रूप में उच्च गुणवत्ता के संरचनात्मक वर्गों में मनाया, Arabidopsis जड़ों में क्रिस्टलीय सेलूलोज के ऊतक विशेष संचय का अध्ययन करने के polscope के कार्यान्वयन की रिपोर्ट। इस विधि को हाल ही में हार्मोन संबंधी गतिविधि 15 के स्थानिक गड़बड़ी के जवाब में क्रिस्टलीय सेलूलोज के सेल प्रकार विशिष्ट संचय का पर्दाफाश किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम Arabidopsis जड़ों रचना विभिन्न ऊतकों में क्रिस्टलीय सेलूलोज के संचय के निर्धारण के लिए एक तरीका मौजूद है, संरचनात्मक जानकारी को बनाए रखते हुए। जैसे, यह एक सेलुलर संकल्प पर पौधों में विकास की प्रक्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
Referências
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. Control of Arabidopsis root development. Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
