Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
Durante casi 50 años los nematodo Caenorhabditis elegans se estableció como un poderoso modelo para estudiar cuestiones importantes en el desarrollo, la neurobiología, la evolución, las interacciones huésped-patógeno, etc. 1 La fuerza de este modelo en el estudio del desarrollo radica en: su ciclo de vida corta de 3 días; la facilidad con que estos animales pueden ser alterados genéticamente; su transparencia que permite la observación de los desplazamientos y la morfología celular en los animales vivos y su desarrollo que es en su mayoría extrauterino. Las etapas de desarrollo del nematodo implican la embriogénesis y cuatro etapas de larvas (L1 a L4), seguido de la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la morfogénesis epidérmica atrajo una considerable atención por su capacidad para permitir una mejor comprensión de cómo epitelial células migran como un grupo, cómo se reorganizan sus uniones y modificar su morfología individual, así como su posición relativa dentro de un epitelio funcional.morfogénesis epidérmico se divide en cuatro etapas: intercalación dorsal que consiste en la reorganización de las células epidérmicas dorsal, referido como la hipodermis; recinto ventral, que consiste en la migración de las células hypodermal ventral hacia la línea media ventral que encierra por lo tanto el embrión en una monocapa de células epiteliales; temprana y tardía de elongación transformar el embrión en forma de frijol en larvas vermiformes. Después de la morfogénesis, la portilla de embriones y larvas L1 comienzan a alimentarse utilizando bacterias disponibles en su entorno inmediato.
por lo tanto la elongación embrionarias es una fase tardía del desarrollo embrionario. Se compone de la extensión del embrión a lo largo de su eje longitudinal y una reducción de su diámetro transversal. Esto implica una modificación dramática de la forma de las células hipodermis. Alargamiento se divide en una temprana y una fase tardía. La primera fase comienza en la fase de coma y termina cuando los músculos del cuerpo de paredes comienzan a contraer en la etapa de 1.75 veces en wde tipo ILD (en peso) de embriones – correspondiente a los embriones que son 1,75 veces mayor en longitud en comparación con los embriones no alargada. Procesos morfogenéticos que se producen en esta fase son impulsados principalmente por la contracción de los haces de actina filamentosa (FB) situados en el polo apical de las células hipodérmicas que impulsan su alargamiento a lo largo del eje antero-posterior del embrión 2. La contracción de los FB es el control por la fosforilación de las cadenas de miosina luz por tres quinasas LET-502 / rock, MrCk-1 y PAK-1 5. La fase tardía de la elongación, comienza cuando los músculos del cuerpo se vuelven funcionales de pared y empiezan contratación. Se trata de la señalización mechanotransduction de los músculos del cuerpo de pared a las células dorsales y ventrales hipodermis y termina cuando los animales salen del cascarón 3.
defectos de elongación se caracterizan generalmente por el porcentaje de animales que mueren como embriones (embriones de letalidad; Emb) y los deteniendo su desarrollo como larvas L1 (fenotipo detención larval; Lva) y ser significativamente más corto que en peso. Identificación de la etapa de detención del desarrollo requiere la observación microscópica de embriones muertos y detenido larvas 3-6.
Recientemente se demostró que varios genes, como el regulador de Cdc42 / Rac y el efector pix-1 y pak-1, el control de los procesos morfogenéticos durante la temprana y tardía de elongación 3,7. También demostraron recientemente que los procesos morfogenéticos difieren a lo largo del eje antero-posterior de los embriones durante la elongación temprana 3 7. Estos hallazgos motivaron el desarrollo de nuevas métricas específicamente dirigidas a las etapas tempranas o tardías de elongación y otras métricas que permiten la caracterización de la morfología de los embriones a lo largo de su eje antero-posterior durante la elongación temprano.
Estos nuevos métodos consisten en la medición de la longitud de los embriones al principio y al final de elongación temprano, así como la anchura de su élanuncios y colas. 7 Dos protocolos también se han desarrollado para medir la longitud de las larvas recién eclosionadas, sincronizada en fase L1 7.
Las cáscaras de huevo de los embriones a proteger contra el tratamiento con hipoclorito alcalino, mientras que las larvas, adultos y bacterias presentes en el medio de cultivo se disuelven por el tratamiento. Este tratamiento se utiliza a continuación para purificar embriones a partir de una población no sincronizada que contiene una mayoría de los bien alimentados adultos 8. la restricción de alimentos se utiliza para sincronizar las larvas recién eclosionadas. La medición de la longitud de estas larvas se usa entonces para detectar defectos de elongación. Esta medición se prefiere sobre la medición de las larvas detenido en placas de cultivo porque las larvas que eclosionan de que no esté totalmente embriones alargados puede recuperar a "longitud normal" cuando la alimentación pero mantendrá su tamaño reducido cuando detenido en la ausencia de alimento.
A continuación, presentamos los protocolos que permitan a la medición de la length de alargarse embriones, así como la anchura de la cabeza y la cola utilizando lapso de tiempo DIC microscopía y análisis de imagen (Protocolo 1). También proporcionamos protocolos detallados para medir la longitud de las larvas sincronizado usando análisis de imágenes (Protocolo 2) y citometría de flujo (Protocolo 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe nuevas métricas para caracterizar principios y fases tardías de la elongación embrionario.
En la sección 1, el paso crítico es la posible presencia de bacterias en la plataforma. Los embriones se encierran herméticamente entre la almohadilla y el cubreobjetos durante la adquisición de imagen. Sellado de la corredera se requiere para evitar la desecación de los animales durante la adquisición que dura más de dos horas. Para nuestro conocimiento, ninguno de lo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genética. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genética. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . Methods. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
