Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
Al bijna 50 jaar gevestigd het aaltje Caenorhabditis elegans zich als een krachtig model op belangrijke vragen in de ontwikkeling, neurobiologie, evolutie, gastheer-pathogeen interacties, enz. Bestuderen 1 De kracht van dit model in de studie van de ontwikkeling ligt in: de korte levenscyclus van 3 dagen; het gemak waarmee deze dieren genetisch kunnen worden gewijzigd; de transparantie dat de waarneming van de cel verplaatsing en morfologie maakt in levende dieren en de ontwikkeling die is meestal extra-uteriene. De ontwikkelingsstadia van de nematode betrekking embryogenese en vier larvale stadia (L1 tot L4), gevolgd door volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling, epidermale morfogenese vestigde aandacht op zijn vermogen om een beter begrip van hoe epitheelcellen migreren als groep, hoe ze reorganiseren hun verbindingen mogelijk te maken en hun individuele morfologie en hun relatieve positie binnen een functioneel epitheel wijzigen.Epidermale morfogenese is verdeeld in vier fasen: dorsale intercalatie bestaande uit de reorganisatie van de dorsale epidermale cellen, als de onderhuid genoemd; ventrale behuizing, die bestaat in de migratie van ventrale onderhuidse cellen in de richting van het ventrale middellijn aldus het embryo in een epitheliale cel monolaag bekisten; vroege en late rek transformeren van de boon-vormige embryo in wormvormig larven. Naar aanleiding van morfogenese, embryo luik en L1 larven beginnen voeden met behulp van beschikbare bacteriën in hun directe omgeving.
Embryonale rek is derhalve een laat stadium van de embryonale ontwikkeling. Het bestaat uit de verlenging van het embryo langs zijn langsas en een vermindering van de transversale diameter. Het gaat om een dramatische verandering van de vorm van hypodermale cellen. De rek wordt verdeeld in een vroege en een late fase. De eerste fase begint bij de komma stadium en eindigt wanneer het lichaam muur spieren beginnen aanbestedende op 1,75 maal het podium in wild-type (wt) embryo – overeenkomt met embryo's die 1,75 maal de lengte in vergelijking met niet-langwerpige embryo. Morfogene processen die zich in die fase worden vooral gedreven door samentrekking van filamenteus actine bundels (FBS) bij het apicale pool van onderhuidse cellen die hun rek rijden langs de antero-posterior as van het embryo 2. Samentrekking van FB is controle door fosforylering van myosine-lichte ketens door drie kinases LAAT-502 / ROCK, MRCK-1 en PAK-1 5. De late fase van het rek, begint wanneer het lichaam muur spieren functioneel geworden en beginnen contracting. Het gaat om mechanotransductie signalering uit het lichaam muur spieren aan de dorsale en ventrale onderhuidse cellen en eindigt wanneer dieren broeden 3.
Rek defecten worden algemeen gekenmerkt door het percentage dieren sterven als embryo (embryonale letaliteit, EMB) en die de ontwikkeling arrestatie L1 larven (larven arrestatie fenotype; Lva) en beduidend korter dan gew. Identificatie van het stadium van ontwikkelings arrestatie vereist microscopische waarneming van dode embryo's en arresteerde Larven 3-6.
Recent werd aangetoond dat meerdere genen, zoals Cdc42 / Rac regulator en effector pix-1 pt pak-1, controle morfogene processen tijdens zowel vroege als late rek 3,7. We hebben onlangs aangetoond dat morfogene werkwijzen verschillen langs de antero-posterior as van het embryo tijdens de vroege elongatie 3 7. Deze bevindingen gemotiveerd de ontwikkeling van nieuwe metriek specifiek gericht vroege of late stadia rek en andere statistieken waardoor de karakterisering van de morfologie van embryo's langs de antero-posterieure as tijdens de vroege rek.
Deze nieuwe werkwijzen omvatten het meten van de lengte van embryo aan het begin en aan het einde van vroege rek en de breedte van hun hijadvertenties en staarten. 7 Twee protocollen werden ontwikkeld om de lengte van de pas uitgekomen larven, gesynchroniseerd op L1 fase 7 meten.
De eierschalen van het embryo beschermen deze tegen alkalisch hypochloriet behandeling, terwijl larven, volwassen en bacteriën in de kweekmedia worden opgelost door de behandeling. Deze behandeling wordt vervolgens gebruikt om embryo's te zuiveren van een niet-gesynchroniseerde populatie een meerderheid van goed gevoede 8 volwassenen. Voedselrestrictie wordt gebruikt om pas uitgekomen larven synchroniseren. Lengtemeetapparaten deze larven wordt vervolgens gebruikt om rek defecten te detecteren. Deze meting heeft de voorkeur boven het meten van gearresteerde larven op kweekplaten omdat larven die uitkomen uit niet-volledig verlengde embryo kan herstellen "normale lengte" wanneer het wordt ingevoerd, maar hun geringe grootte handhaven wanneer gearresteerd in afwezigheid van voedsel.
Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen waardoor de meting van de length van het verlengen van embryo's, evenals de breedte van de kop en de staart met behulp van time-lapse DIC microscopie en beeldanalyse (Protocol 1). We bieden ook gedetailleerde protocollen om de lengte van gesynchroniseerde larven met behulp van beeldanalyse (Protocol 2) en Flow-Cytometry (Protocol 3) te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft roman metrics om vroeg te karakteriseren en late stadia van de embryonale rek.
In hoofdstuk 1, de kritische stap is de mogelijke aanwezigheid van bacteriën op het pad. De embryo's zijn hermetisch afgesloten tussen het pad en het dekglaasje tijdens beeldacquisitie. Het afdichten van de slide is nodig om uitdrogen van de dieren tijdens het verwerven die meer dan twee uur duurt te voorkomen. Voor zover wij weten, geen van de jagers gebruikt om agarose pads tussen gl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., & Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., & Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H. et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M. et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C. et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119, (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., & Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E. et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., & Hodgkin, J. in Methods. (ed W. B. Wood) 587-606 (1988).
- Andersen, E. C. et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., & Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., & Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K. et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., & Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., & Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., & Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., & Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
