Система впрыска под давлением для исследования Нейрофармакология обработки информации в Awake Behaving макаки Cortex

Summary

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

Abstract

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

Introduction

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine¹. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies², as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals³ and systemic pharmacological manipulations in humans⁴. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems^5,6 and can lead to changes in neural activity³.

Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug⁷. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules⁸, correlating with the tip diameter⁹ of the micropipette as well as with the concentration⁸ of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used¹⁰, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.

Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley¹¹ for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain¹²) to a defined brain area¹³ while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette¹³. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly¹⁴ and intracellularly^15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see¹⁷ for a comparison of recent pressure injection systems).

An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.

The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

Protocol

Уход за животными и все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с немецким законодательством, регулирующим ухода за животными и утверждается районным правительством Брауншвейг, Нижняя Саксония, Германия. Примечание: Поскольку эксперимент проводится в естественных условиях, крайне важно для поддержания высоких стандартов гигиены. Всякий раз, когда это возможно, работать в стерильных условиях. 1. Подготовка инъекции / регистрирующей системы Стерилизацию трубку, которая соединяет микропипетки со шприцем. Используйте самую короткую длину трубы возможно в экспериментальной установке между топливным насосом и электрофизиологические системы записи. Очистите направляющие трубы системы записи, используя чистящие провода. Окунуть их в стерильной силиконовое масло и кормить их через отдельные направляющие трубки несколько раз. Вставьте стекло микропипетки кварца в одну направляющую трубку системы записи. Смотрите рисунок 1А. После фиксации микропипетки всистема записи, приложите стерильную трубку к металлическим штифтом микропипетки. Береги себя; хотя микропипетки фиксируется в системе он может легко сломать при креплении трубки. Используйте две стерильные пинцет для применения одинакового давления на штыре и трубки. Используйте жидкий клей высшего качества для герметизации стыка между трубой и микропипетки. Подождите, по крайней мере, 3 часа для клея, чтобы затвердеть перед заполнением микропипетки жидкостью. Вставьте микроэлектродов (например, из кварцевого стекла изоляцией платины вольфрама) в других положениях системы записи до или после вставки микропипетки. 2. Подготовка Вещество Стерилизовать 1,5 мл микроцентрифужных пробирок для последующего хранения растворов для инъекций с использованием автоклава или другой надежной процедуры. Взвесить соответствующее вещество скополамин гидрохлорид с получением раствора 5 мл 0,1 М раствора. Растворить в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl). В стерильных условиях Iна вытяжным колпаком, профильтровать раствор с помощью шприца фильтр с достаточно большим диаметром пор, например, 0,2 мкм. Под вытяжкой, Алиготе раствора в объемах , достаточных для одного эксперимента, например, для скополамин, 500 мкл в стерильной 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Используйте темные трубы для защиты от света вещество; В качестве альтернативы, обернуть трубы в алюминиевую фольгу. Для скополамин, хранить решение в срок до 14 дней при температуре 4 ° C. 3. Ежедневно Подготовка инъекций / Система записи Примечание: При установке в системе записи, электроды и микропипетка сохраняются в растворе фермента (Tergazyme, 1% раствор деионизированной водой) между записями. Следующие шаги должны быть выполнены перед каждой записью. Соберите трубку вещества для инъекций. Позвольте ему достичь RT, если в холодильнике. Снимите систему впрыска / записи из ферментного раствора и прополоскать электродыи микропипетка деионизированной водой, чтобы очистить полностью ферментного раствора. Снимите переднюю крышку системы записи для того, чтобы визуально проверить уплотнение между микропипетки и трубкой. Нанесите стерильную силиконовое масло в зазор направляющей трубы (смотри рисунок 1А) и кончиков электродов и микропипетки для того , чтобы смазывать систему для плавного движения. Проверьте кончики электродов и микропипетки с помощью микроскопа, чтобы гарантировать, что они не повреждены. Align электроды и микропипетки под микроскопом так, чтобы они выходили из направляющих труб с одинаковой длины. Гнать их в направляющие трубки, останавливаясь, как только они больше не будут видны. Это определяется как положение электрода нулевой. Установите глубину электродов и микропипетки до 0 в программном обеспечении. Заполните стерильный шприц стерильным физиологическим раствором и вставить иглу в трубку, следя за тем, чтобы не проколоть стенку трубы. Привод микропипетки из направляющей трубки для Visuаль контроль потока вещества. Промывка по меньшей мере, 2 мл стерильного физиологического раствора через трубку и микропипетки чтобы убедиться в отсутствии воздуха остается в шприце или в трубке. Не наносите слишком большое давление на поршень шприца. Убедитесь, что соединение между трубкой и микропипетки запечатан. Если утечка видна, повторно клеить стык (этап 1.5) и отложить запись. Заполните новый стерильный шприц с раствором для инъекций и обмен его со стволом солевого шприца, то есть, держать иглу солевом заполненного шприца в трубке. Убедитесь, что воздух не передается в систему. Это лучше всего достигается путем заполнения иглодержатель с физиологическим раствором после удаления заполненные физиологическим раствором ствол. Промыть систему с 250 мкл раствора для инъекций, для того, чтобы полностью удалить физиологический раствор из трубки. С помощью программного обеспечения управления двигателем, убирается электроды и микропипетки в guidetubesto глубину, по меньшей мере -500 мкм. <lя> Нижняя направляющая труба кольцо (рис 1А) к нижней части направляющих труб для поддержания их фиксированное относительное положение. Очистите основание системы с этанолом, в частности, где он будет касаться записи камеры обезьяны. Закройте систему записи, заменив переднюю крышку и затянув винты. 4. Проверка системы впрыска топлива Примечание: Несмотря на то, что компания калибрует систему, рекомендуется проверять выброшенного объемы с материалами, используемыми в экспериментальной установке (пробирки, шприцы и т.д.). Подготовьте систему, как описано в шаге 3, сохраняя электроды и микропипетки вытягивается из направляющих труб. На глубину по меньшей мере, 7000 мкм, рекомендуется, чтобы избежать потери объема измерений из-за адгезии вдоль внешней поверхности микропипетки и электродов. Установите систему записи в положении она будет использоваться в ходе эксперимента и поставить СиринGE в микроинъекции насос. Закрепите шприц на месте , используя резиновую ленту и регулируемую ручку (рис 1А). Сдвиньте подвижную часть насоса, пока она не встанет на место за поршень шприца. Использование программно-управляемый блок двигателя, вытолкнуть объем достаточно большой , чтобы быть точно измерено, например., 1000 п. Предпочтительно использовать один шаг, чтобы извлечь общий объем для того, чтобы избежать эффектов под действием капиллярных сил вдоль поверхности микропипетки. Очень низкая скорость (1 нл / с) также может привести к этому эффекту во время процедуры проверки. Собирают общий объем в контейнере, помещенных под микропипетки, или необходимо тщательно собрать выброшенный капли непосредственно от кончика микропипетки. Расчетный объем выбрасываемого с помощью пипетки или путем взвешивания с точностью масштаба. Повторите эту процедуру несколько раз, чтобы подтвердить измерения. 5. Острые Recordings Установите положение хусистемы записи. Это определяет точку, в которой направляющие трубки достичь твердой мозговой оболочки в пределах хронически имплантированного записи камеры. Убедитесь, что направляющие трубы убираются полностью (направляющей трубки г положение 0). Привести систему записи в исходное положение и поместите шприц в микроинъекции насосе. Закрепите шприц на месте , используя резиновую ленту и регулируемую ручку (рис 1А). Сдвиньте подвижную часть насоса, пока она не встанет на место за поршень шприца. Если капля вещества видна на кончике направляющих труб, тщательно удалить его с помощью стерильной ватным тампоном. Подготовьте животное для записи в соответствии с процедурой лаборатории (см 18 к примеру руководящих принципов). Надежно установите систему записи на записи камеры обезьяны. Медленно вручную опустить направляющие трубки в записи камеру, пока твердая мозговая оболочка не будет достигнуто, то привод электродов с помощью сотрудничества двигателяПрограммное обеспечение управляете. Поскольку это не представляется возможным измерить сопротивление микропипетки, первый привод с электродами и регулярно проверять их импедансы на разных глубинах. После проникновения ТМО успешно выполнена без повреждения электродов, заранее микропипетки. Привод электродов и микропипетки на глубину электрод-мишень, на которой область мозга, представляющая интерес, как ожидается, будет найден. Медленно электрод, пока не будет достаточно близко, чтобы записать деятельность одного блока, о чем свидетельствует хорошее отношение сигнал-шум в записываемый сигнал. Важно отметить, что положение записи электрода и микропипетки на той же глубине, чтобы обеспечить минимальное расстояние между электродом и микропипетки. Если это возможно, держать электроды и микропипетки на этой глубине в течение всей записи. Тем не менее, если единственный способ сохранить качество сигнала записанной ячейки для перемещения электродов, а затем привод электродов и микропипеткиодновременно для поддержания расстояния между ними. 6. Пространственное Внимание Задача В серии испытаний, присутствующих двух движущихся моделей точка на экране, один расположен в пределах рецептивного поля записанного нейроном и другой вне его, вместе с центрально представленной точки фиксации , что животное должно foveate на протяжении каждого испытания 19, 20. Примечание: обезьяна обучена реагировать на изменение направления в подают реплики точечного рисунка (целевое событие), игнорируя при этом каких – либо изменений направления в другой точечного растра, и вознаграждается с каплей жидкости для каждого успешного завершения судебного процесса 19, 20. В качестве сенсорной контрольной группы , обезьяна должна сообщить об изменении яркости точки фиксации, игнорируя при этом обе подвижные узоры точки (рисунок 2 для более подробного описания задачи). 7. Фармакологическая Манипуляция во время записи <p> Примечание: В то время как обезьяна выполняет задачу, вводят вещество в поблочно образом. Определены три последовательных блоков: управления, который действует в качестве основы; инъекции, в течение которого вещество выбрасывается; и восстановление, в течение которой клетки мишенью инъекционной возвращение к исходному. Во время блока инъекции, вводят предварительно определенного количества вещества через регулярные промежутки времени , например., 2 NL каждую минуту со скоростью 2 л / с. Для этого примера, использование скополамина гидрохлорид. Процесс впрыска управляется с помощью программного обеспечения, которое обеспечивает различные варианты. Например, можно использовать ступенчатую функцию, чтобы определить объем впрыска, и нажмите кнопку инъекции каждую минуту по часам программного обеспечения записи. Примечание: Точная длительность блока впрыска является веществом и эксперимента зависит, например, для использования скополамин 2 NL инъекции каждую минуту в течение 10 мин (20 нл в общей сложности).. Предпочтительно, чтобы не наступать электроды и микропипетка Дуринг блок инъекции. Обратите внимание на время и судебный процесс, в течение которого вещество впрыскивании глубину электродов и микропипетки, а также количество выброшенного вещества. Выполните блок впрыска с блоком восстановления, в котором не впрыскивают ни одно вещество. Длительность блока восстановления является вещество конкретным и должно быть определено в предварительных тестах. Монитор и не поддерживать качество записи выбранных отдельных единиц до конца блока восстановления. Повторите три блока до тех пор, пока качество записи и мотивация обезьяны позволяют. 8. Процедуры после записи После записи данных, убирается электроды и микропипетки в направляющих труб, а затем вручную убирается направляющих труб. Удалить систему записи из записи камеры обезьяны. Отпустите шприц из топливного насоса высокого давления и переноса системы в области подготовки для очистки. Ручка животное( в том числе очистку камеры 18 записи) в соответствии со стандартными процедурами лаборатории и вернуть его в жилищном объекте. Промыть наружную поверхность направляющих труб с перекисью водорода (3%), а затем деионизированной водой. Привод электродов и микропипетка из направляющих труб, полоскание перекисью водорода, а затем деионизированной воды. Заменить ствол шприца с бочонком шприца, заполненного стерильным физиологическим раствором, держа иглу в трубке. Промыть пробирку и микропипетки с 1-2 мл физиологического раствора. После промывки, снимите ствол и заполнить его с воздухом. Заново ствол в иглу и высушить трубку и микропипетки изнутри, осторожно толкая воздух через. Хранить направляющие трубы, расширенные электроды и микропипетки, погружали в раствор фермента, чтобы избежать высыхания, а также, чтобы обеспечить распад органического материала.

Representative Results

На рисунке 2 представлена ​​пространственная задача внимание обезьяны выполняться во время процесса инъекции проводили. Обезьяна была обучена для участия либо стимула, расположенного в пределах рецептивного поля записанного нейроне (участие в), стимул, расположенный за пределами рецептивного поля (участие отказа) или точки фиксации (присутствовать-FIX). Эти условия позволяют сравнение активности нейронов в различных состояниях сосредоточения внимания. На рисунке 3 показана пери-стимул времени гистограмма образца нейрон в эксперименте с использованием скополамин мускариновый холинергической антагонист. График демонстрирует подавление реакции во время инъекции скополамина по сравнению с отсутствием инъекции, когда паттерн движется в выделенном направлении клетки представлена ​​внутри рецептивного поля нейрона и принимают участие животного. Две первые пики представляют собой нейрон9; s ответ на балансовые и смещение пространственного реплике, которая появляется внутри его рецептивного поля. За этим следует ответ на движущийся узор, который появляется на экране 500 мс после того, как кий начала. Серая заштрихованная область изображает период анализа, используемый для расчета средней скорости стрельбы для каждого испытания. Зеленая зона подчеркивает угнетающее влияние инъекции скополамина на скорость стрельбы клетки. Темно-зеленая зона показывает подавление в течение периода анализа. На фиг.4А показан эффект скополамина на частоте возбуждения образца нейрон в каждом из трех условий сосредоточения внимания. Скорость нейрона стрельбы для двух пространственных условий внимания (внимание внутри или снаружи рецептивного поля нейрона записи), а также для чувственного состояния (внимание на точки фиксации) упал вскоре после первой инъекции блока впрыска (серый затененном находятсяа) и в течение блока восстановления увеличивается после задержки на том же уровне, как и до инъекции. На фиг.4В показан управление записью из второго образца нейрон , в котором вводился физиологический раствор (0,9% NaCl), используя тот же протокол, для инъекции скополамина. Во время инъекции блок не наблюдалось каких-либо изменений в скорости стрельбы нейрона по сравнению с блоком управления. Рисунок 1. Набор вверх используется для фармакологической манипуляции во время записи. (А) Изображен микроинъекции насос и электрофизиологические систему записи , оборудованный электродами и микропипетки. Разрыв guidetube, в которой силиконовое масло вводится для смазки электродов и микропипетки, показан в увеличенном виде. (B) показан пример микропипетки (выше)и записывающий электрод (ниже). Для сравнения размера, евроцент (диаметр 16 мм). Помещается под Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Конструкция задач для руководства пространственного внимания. Обезьяны были обучены , чтобы обнаружить изменение направления движения в точечного растра подают реплики. Кий был либо в пределах рецептивного поля нейрона (участие в), как показано на рисунке, или за ее пределами (участие в отъезде). В качестве сенсорного управления, обезьяна была обучена , чтобы обнаружить изменение яркости точки фиксации (присутствовать-фикс). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. < IMG Alt = "Рисунок 3" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" /> Рисунок 3. Влияние антагониста скополамин на скорость стрельбы. Пери-раздражитель времени гистограмма для образца нейрон показан для-в посещают состоянии (внимание внутри рецептивного поля записанного нейрон) во время блока впрыска и во время контрольного блока. Ось х показывает время в миллисекундах после кия начала и оси у показана скорость стрельбы в шипы / сек. Серая зона изображает период анализа (300-800 мс после начала стимула), используемый для расчета скорости стрельбы проб усредняется. Зеленая заштрихованная область показывает подавление в скорости через двух условий стрельбы. Темно – зеленый цвет подчеркивает подавление в течение периода анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/> Рисунок 4. Влияние скополамина и физиологического раствора на скорость стрельбы. (A) Антагонист инъекции скополамин. Проба усредненный скорострельность ячейки образца на рисунке 3 по ходу эксперимента показан на предпочтительный стимул для всех трех условий сосредоточения внимания. Ось х показывает время начала пробное в течение нескольких минут, а ось ординат показывает скорость стрельбы аппарата в спайки в секунду. Символы ( участие в, присутствовать-FIX, присутствовать на выход) представляют скорость стрельбы нейрона в течение периода анализа в каждом успешно проведены испытания и горизонтальные линии (сплошная линия: участие в, пунктирная линия: присутствовать-FIX, прерывистая линия: присутствовать на выход) показывают среднюю скорость стрельбы для три различных экспериментальных блocks (контроль, инъекции, восстановление). Серая заштрихованная область показывает блок впрыска, начиная с первой инъекции и заканчивая 1 мин после последней инъекции. Во время инъекции блок 2 нл 0,1 мольного скополамина вводили каждую минуту со скоростью на инъекционном 2 л / с. (В) Физиологический раствор для инъекций. Стрельбы скорость клеточного образца за ходом контрольного эксперимента показан на предпочтительный стимул для всех трех условий сосредоточения внимания. Серый затененной области визуализирует блок инъекции физиологического раствора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Здесь мы подробно показано, как выполнить надежные и точные инъекции и высокое качество записи одноклеточных с "вне-шельф" впрыска под давлением системы. В то время как этот способ доставки лекарственных средств ранее использовалось в себя обезьян (обзор в ^17), система , представленная здесь , имеет преимущества, рассмотренные ниже.

Как показано на фиг.4А, система , описанная здесь , может обеспечить стабильное измерение одной нейронной активности с использованием и без фармакологических инъекций в непосредственной близости от места записи. Как показано на фиг.4В, инъекция контрольного вещества, физиологический раствор, не приводило к изменению скорострельность. Этот контроль показывает, что сам процесс инъекции не оказывает ощутимого влияния на свойства теплотехнической записанных нейронов.

Пространственная конфигурация нейроне, записи электрода и микропипетки имеет решающее значение значение в этих экспериментах. Хотя точное измерение их относительных позиций в ткани во время записи не представляется возможным, мы можем рассмотреть и контроль за возможными источниками дисперсии. Во-первых, во время инъекции объема существует риск того, что нейрон интерес может быть смещен в сторону от регистрирующего электрода, влияя на стабильность записанных сигналов. По этой причине целесообразно сравнить скорострельность до и после блока впрыска для проверки стабильности сигнала. Во- вторых, конфигурация направляющей трубки системы регистрации определяет расстояние между электродами и микропипетки (например., 305 мкм в концентрической системе 3-канала , используемого в этом эксперименте). Поскольку система обеспечивает точное управление положением для глубины электродов и микропипетки в ткани, то расстояние между ними может быть сведено к минимуму путем тщательного калибровки относительную глубину до начала записи (этап 3.5), и держать их в общей глубине во время записи.

лор "> Потенциальные ограничения
В дополнение к в доме контроля качества со стороны производителя, система должна быть подтверждена в лабораторных условиях, в качестве различных марок труб, шприцы и т.д. могут быть использованы и может привести к различиям в выбрасываемых объемов. Хотя система может быть использована для введения очень малых объемах, как в эксперименте, показанном здесь, это ниже минимального объема, который может быть проверен из-за практических ограничений измерения в нормальных лабораторных условиях. Тем не менее, большие объемы нагнетательных можно использовать для вывода соотношения между программируемыми параметрами объема и объема, выброшенного аппаратными средствами. Если используются прозрачные трубки, дополнительный визуальный контроль процесса впрыска возможно путем измерения смещения визуального маркера.

Вставка микропипетки в систему является более сложным, чем для вставки электродных, как диаметр микропипетки немного больше, и материал более хрупким. К тому же,присоединение трубки к контакту микропипетки является сложной задачей, поскольку это влечет за собой высокий риск разрыва верхней части микропипетки. Тем не менее, время жизни успешно загружен микропипетки несколько месяцев, даже при ежедневном использовании.

На практике мы еще не сталкивались с засорение в системе впрыска во время очистки после записи системы. Тем не менее, ни один "онлайн" проверка не возможно, и существует риск того, что физическое закупорка (например, ткани на кончике микропипетки), может предотвратить инъекции вещества. Поэтому было бы целесообразно проанализировать данные консервативно, в том числе таких, как только те клетки, в дальнейшем анализе, которые показывают значительные изменения в стрельбе скорости между контрольными и нагнетательных блоков эксперимента.

Несмотря на их малый диаметр, микроэлектродов и пипеток сместит ткани головного мозга и может вызвать некоторые местные повреждения тканей. Это может быть сведено к минимуму с помощью вручную позиционированием иглы ВЭС-е направляющие трубки непосредственно над твердой мозговой оболочки. Электроды затем проникают в твердую мозговую оболочку и их нетронутость выводится путем измерения их импедансы онлайн. После этого микропипетка вставляется. При использовании этого подхода, регулярное удаление ткани над твердой мозговой оболочки, рекомендуется, чтобы дополнительно уменьшить риск электрода или пипетка поломки.

Сравнение с альтернативными методами
Система, используемая здесь, показывает явные преимущества по сравнению с другими системами впрыска под давлением. Одним сильным преимуществом является диаметр микропипетки (приблизительно 100 мкм), что в два раза меньше других доступных зондов ¹⁷ и , следовательно , сводит к минимуму повреждение нервной ткани. В отличие от предыдущих конструкций, текущая система использует пространственно разнесены записи электрода и микропипетки. Хотя другие системы обеспечивают меньшее расстояние между электродом и пипетку, система, описанная здесь, позволяет независимые изменения глубины электродов и пипетку, таким образом пермипеременные относительные к раб расстояния в пределах сеанса записи. Важно отметить, что никаких компромиссов в отношении качества записи не должно быть сделано, поскольку система впрыска является продолжением установленного записывающего устройства. В то время как только один микропипетка и, таким образом, одно вещество используется в данном протоколе, можно вводить несколько веществ в пределах одной экспериментальной процедуры. Для достижения этой цели несколько микропипетки может быть ввинчен в отдельные направляющие трубки и подключены к шприцам, смонтированных в отдельных насосов впрыска. И, наконец, управление системой легко, так как только одна компьютерная программа необходима для продвижения электродов и микропипетки, а также для выполнения инъекции давления в ходе эксперимента.

Сравнивая давление впрыска для ионофореза, есть относительные преимущества и недостатки. Например, давление впрыска требует больших объемов, чтобы вводить в ткани, чем ионофорез, тем самым увеличивая риск нейронного смещения. Ток протоCol используются объемы в диапазоне Н.Л., и мы редко испытывали заметные изменения в качестве сигнала проведено заносимое клетки. Система также позволяет большие объемы для инъекций, который является потенциально полезным для поведенческих манипуляций, но может повлиять на стабильность нейронного записи. Явным преимуществом впрыска давления над ионофореза является большее разнообразие годные к употреблению веществ, так как не требуется использовать заряженные вещества. Однако значения рН должны быть проверены и сопоставлены между экспериментальными и контрольными веществами (например., Физиологический раствор).

Может возникнуть вопрос, почему использовать устоявшееся метод инъекции давления вместо новых методов, таких как оптогенетика для манипулирования нейронной активности. Хотя хорошо известно у грызунов, оптогенетика еще не достоверно установлено в макак-резусов. В частности, пока не позволяет локальную манипуляцию клеток селективным для определенного типа нейромедиаторов. В более долгосрочной перспективе, мы видим,большой потенциал для сочетания преимуществ фармакологических манипуляций с преимуществами optogentic манипуляций в выяснении нейронную основу когнитивных функций.

Здесь мы показали, как давление впрыска может быть использован для его фармакологически манипулировать локально ограниченную область в мозге бодрствования, ведут себя макак-резус. Мы надеемся, что этот метод вдохновляет других ученых исследовать neuromodulatory вклад в динамику активности нейронов.

Materials

(-)-Scopolamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzyme detergen
Hydrogen peroxide	Roth		Used in 3% solution with deionized water
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Deionized water
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Syringe and needle
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Quarzglass micropipette	Thomas Recording
Recording electrode	Thomas Recording		quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ  and 0.3-0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Silicon oil	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761———-R	Syringe filter
Multichannel Micro Injection System	Thomas Recording		multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump
McLab	custom		internal lab software to control stimulus presentation